解纖維素熱酸菌來源的耐熱磷酸酶的酶學性質與應用

白 雪，李運杰，孟冬冬，魏欣蕾，路福平，游 淳

(1. 天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2. 中國科學院 天津工業生物技術研究所，天津 300308)

含有磷酰基轉移酶的鹵代酸脫鹵酶(HAD)家族是酶類中已知的最大超家族之一，包括Mg2+依賴的磷酸酯酶、P型ATP水解酶、磷酸酶、磷酸化葡萄糖異構酶等[1-3]。HAD磷酸酶的三維結構由α/β-水解酶核心結構域和覆蓋于其上的帽子結構域構成，核心結構域在家族中都保持著嚴格的序列保守性和結構保守性，帽子結構域的N端部分具有高度可變性，在參與形成活性位點的空腔時，會影響底物特異性[4-7]。因此，磷酸酶具有廣泛的底物譜。

HAD磷酸酶廣泛存在于微生物中，參與維持細胞的初級代謝和次級代謝等生理調控功能。目前，有大量磷酸酶的催化活性已得到功能注釋，例如：來自大腸桿菌(E.coli)中的3-脫氧-D-甘露糖醛酸8-磷酸磷酸酶(YrbI)[8]、海藻糖6-磷酸磷酸酶(OtsB)[9]；來自詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)[10]；來自嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)的磷酸甘油酸磷酸酶[11]；來自多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的無機焦磷酸酶[12]等。由于HAD磷酸酶所催化的脫磷反應是不可逆的，這些磷酸酶常常被作為催化反應的最后一步整合在體外多酶體系中，推動整個體系向著生成產物的方向進行,從而得到較高的產品得率。因此，在理論上，基于磷酸酶的體外多酶體系能夠實現產物的高得率。例如：從大腸桿菌中獲得的果糖-1-磷酸磷酸酶(YqaB)用于生產D-山梨糖和D-阿洛酮糖[13]或L-果糖和L-塔格糖[14]等稀有糖；來自海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)的嗜熱肌醇單磷酸酶(IMP)被引入體外合成體系，實現了20 t規模的肌醇生產[15]。嗜熱酶具有更高的魯棒性,整個反應體系更穩定,不易染菌，因此應該選擇熱穩定性高的酶構建體外多酶體系。除此之外，高的反應溫度能夠降低反應液黏度、提高體系傳質速度，從而提高整個反應體系的反應速度。鑒于多數磷酸酶具有底物多樣性，尋找底物特異性高的磷酸酶，挖掘嗜熱菌來源的耐熱磷酸酶，將其用于生物制造平臺，具有重要的研究意義。

本研究中，筆者從最適生長溫度為55 ℃的解纖維素熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)基因組中，通過基因組數據挖掘的方法檢索到一個HAD超家族的磷酸酶基因，并將其命名為AcPase,將該磷酸酶基因在E.coliRosetta (DE3)中進行異源表達，并對其底物特異性等酶學性質進行表征;隨后，將其整合入體外多酶體系中并對該體系降解纖維素生產葡萄糖的功能進行研究，以期為纖維素降解提供一條不依賴于纖維素酶的分解路線。

1 材料與方法

1.1 材料菌株與試劑

1.1.1 菌株與質粒

菌株EscherichiacoliRosetta (DE3)保藏于中國科學院天津工業生物技術研究所體外合成生物學中心。所用的磷酸酶基因AcPase由安徽通用生物系統有限公司合成并克隆至載體pET20b(+)。

1.1.2 試劑與培養基

氨芐霉素和氯霉素，生工生物工程(上海)有限公司；Sepharose His TrapHP，美國Bio-Rad公司；MOPS和Bradford蛋白濃度測定試劑盒，Sigma公司；葡萄糖氧化酶法測定試劑盒，北京普利萊基因技術有限公司。其他試劑均為市售國產分析純。

LB培養基：胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L；pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 重組菌E.coliRosetta (DE3)/pET20b(+)-AcPase的構建

根據蛋白的功能預測，從NCBI上查獲GenBank序列號為ABK51875.1的磷酸酶基因序列。基因由安徽通用生物系統有限公司按照E.coli密碼子的偏好性進行基因序列優化并合成，亞克隆于pET20b(+)載體中，選擇酶切位點為NdeⅠ/XhoⅠ，C端帶有6×His Tag標簽，獲得質粒pET20b(+)-AcPase。將重組質粒轉化到E.coliRosetta(DE3)感受態中，選取氨芐青霉素和氯霉素雙抗性平板上的陽性菌落。

1.2.2 重組蛋白的誘導表達

挑取重組菌單菌落，接種于含100 mg/L氨芐青霉素和33 mg/L氯霉素的LB培養基中，在37 ℃、250 r/min條件下振蕩培養過夜。以體積分數1%的接種量轉接于裝有200 mL含100 mg/L氨芐青霉素和33 mg/L氯霉素的LB培養基中(1 L三角瓶)，于37 ℃、250 r/min搖床中培養至OD600達到0.6～0.8時，降低培養溫度至16 ℃，加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，16 ℃、250 r/min誘導16～20 h表達蛋白。發酵結束后離心收集菌體，用0.9% NaCl溶液洗滌菌體2次，再用含有50 mmol/L NaCl的50 mmol/L 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)緩沖液(pH 7.0)重懸菌體。在冰上超聲破碎，菌體破碎液于4 ℃離心機中12 000 r/min離心10 min，得到重組酶的粗酶液。

1.2.3 重組蛋白的純化

采用鎳柱親和層析法純化附有組氨酸標簽的重組蛋白，步驟如下:His Trap HP樹脂柱用結合緩沖液A(50 mmol/L MOPS、50 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑，pH 7.0)平衡；粗酶液流經樹脂柱后，利用緩沖液A洗去雜蛋白；用洗脫緩沖液B(50 mmol/L MOPS、50 mmol/L NaCl、500 mmol/L 咪唑，pH 7.0)梯度洗脫目的蛋白。收集含有目的蛋白的流出液，經超濾離心管(104)濃縮并去除咪唑。通過SDS-PAGE檢測目的蛋白的分子量和純度。采用Bradford法測定蛋白濃度。

1.2.4 磷酸酶活力測定及酶的底物譜測定

在0.3 mL反應體系中，將60 μg的AcPase與含5 mmol/L MgCl2的0.1 mol/L MOPS緩沖液(pH 6.0)混合，50 ℃預熱2 min，分別加入同樣預熱的終濃度10 mmol/L的D-葡萄糖-1-磷酸(G1P)、D-葡萄糖-6-磷酸(G6P)、果糖-6-磷酸(F6P)、果糖-1,6-二磷酸(FDP)、D-葡糖胺-6-磷酸(GlcN6P)、D-塔格糖-6-磷酸(T6P)、D-阿洛酮糖-6-磷酸(P6P)、D-甘露糖-6-磷酸(M6P)和1 mmol/L的對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)進行反應，冰浴終止反應。

采用無機磷酸測定法[16]檢測生成的磷酸含量。酶活定義：在一定的條件下，每分鐘轉化產生1 μmol磷酸所需的酶量為一個酶活單位U。

以pNPP為底物時，添加終濃度0.75 mol/L的硼酸鈉終止反應，產生的產物對硝基苯酚(pNP)通過405 nm下的吸光度進行測定。酶活定義:在一定的條件下，每分鐘轉化產生1 μmol pNP所需的酶量為一個酶活單位U。

1.3 重組酶的酶學性質分析

1.3.1 重組酶的最適反應溫度及其穩定性

將重組酶與含10 mmol/L G6P、5 mmol/L MgCl2的0.1 mol/L MOPS緩沖液(pH 6.0)混合，分別置于不同溫度(30、40、45、50、55、60、65、70、75、80和90 ℃)下反應10 min，測定酶活，確定最適反應溫度。將3 g/L純化后的酶分別放置在45、55和65 ℃條件下，熱處理不同時間，取出熱處理后的酶液，在50 ℃下測定各時間點的剩余酶活力，與初始酶活進行比較,考察酶在不同溫度下的穩定性。

1.3.2 重組酶的最適pH

將重組酶分別與濃度均為0.1 mol/L的甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 4.0、4.5和5.0)、乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0、5.5和6.0)、MOPS緩沖液(pH 6.0、6.5和7.0)和HEPES緩沖液(pH 7.0、7.5和8.0)混合，再加入終濃度10 mmol/L G6P和5 mmol/L MgCl2進行反應，在50 ℃下測定酶的最適pH。

1.3.3 不同金屬離子對重組酶活性的影響

在酶與含10 mmol/L G6P、0.1 mol/L MOPS緩沖液(pH 6.0)的混合體系中，分別加入終濃度為5 mmol/L的MgCl2、CoCl2、MnCl2、NiCl2、ZnCl2、CuCl2、CaCl2和FeCl3溶液，未加任何離子反應體系的酶活定義為100%，測定金屬離子對重組酶活性的影響。

1.3.4 重組酶動力學參數的測定

在50 ℃下，含5 mmol/L MgCl2的0.1 mol/L MOPS緩沖液(pH 6.0)中，分別添加不同濃度的底物G1P(0.5～50 mmol/L)、G6P(0.5～20 mmol/L)和F6P(0.5～20 mmol/L)，以產物磷酸的變化量計算初始速率，采用GraphPad Prism 5.01軟件的Michaelis-Menten方程,經非線性回歸計算該重組酶的酶動力學參數(Km、Vmax和kcat)。

1.4 重組酶的應用

質粒pET21c-CtCDP、pET20b-CtCBP和pET20b-CtPGM分別用于表達重組蛋白纖維多糖磷酸化酶(CDP)、纖維二糖磷酸化酶(CBP)和磷酸葡萄糖變位酶(PGM)，其編碼蛋白基因cdp、cbp和pgm均來源于嗜熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)。酶活測定方法參照文獻[17]。

利用體外多酶系統催化纖維素完全轉化生成葡萄糖。1 mL反應體系包含經酸水解方法[17]預處理的5 g/L纖維多糖(25 mmol/L葡萄糖)，5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L K2HPO4-KH2PO4、1 U CDP、1 U CBP、1 U PGM、1 U AcPase(相對葡萄糖6-磷酸的比酶活)、0.1 mol/L MOPS緩沖液(pH 6.0)，50 ℃、600 r/min反應5 h。本研究中所用纖維多糖的平均聚合度(degree of polymerization，DP)為2.9，DP值為纖維多糖中葡萄糖單元的摩爾數與還原端摩爾數的比值。采用葡萄糖氧化酶法測定試劑盒來測定產物葡萄糖的含量。

2 結果與討論

2.1 重組酶的誘導表達與純化

重組菌E.coliRosetta (DE3)/pET20b(+)-AcPase經IPTG誘導表達后，超聲破碎后的全菌液和離心后的上清液經SDS-PAGE電泳驗證，如圖1所示。由圖1可知，在分子量大約3.0×104處出現明顯的特異性條帶，而來源于A.cellulolyticus的重組酶是由287個氨基酸組成，與預期重組酶的理論分子量(3.01×104)大小一致，說明重組菌成功表達可溶性蛋白。上清液經鎳柱純化后獲得了電泳純目的蛋白，可用于進一步研究。

M—標準蛋白; T—total cell lysate; S—supernatant ofthe cell lysate; Ni-NTA—purified AcPase圖1 SDS-PAGE分析重組菌E. coli Rosetta (DE3)表達和純化的蛋白AcPaseFig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant AcPase expressed and purified from E. coli Rosetta (DE3)

AcPase純化結果如表1所示。由表1可知:300 mL重組菌經純化后獲得11 mg蛋白，在鎳柱純化過程中，蛋白存在一定損失，導致酶活性回收率為32.2%。

表1 來源于A. cellulolyticus的AcPase的純化

2.2 重組酶的底物譜

磷酸酶或磷酸單酯酶(EC 3.1.3-)具有廣泛的底物譜，可水解多種天然底物中的磷酸單酯鍵，包括小分子的核苷酸、糖和糖醇或蛋白質。本研究中AcPase對多種磷酸鹽物質的底物特異性如表2所示。由表2可知，重組磷酸酶對G1P、G6P、F6P、FDP、GlcN6P、T6P、P6P、M6P和pNPP均顯示磷酸酶活性。其中，在50 ℃下，AcPase對G6P的比酶活為0.685 U/mg，對G1P的比酶活為0.323 U/mg，對P6P、F6P的比酶活約為0.2 U/mg。由此可見，來源于A.cellulolyticus的AcPase屬于糖酸化酶并且擁有廣泛的底物譜。

表2 AcPase的磷酸酶底物特異性

2.3 重組酶的酶學性質分析

2.3.1 重組酶的最適溫度及其穩定性

解纖維素熱酸菌(A.cellulolyticus)的最適生長溫度為55 ℃，但是酶的最適催化溫度與菌的生長溫度不一定一致。因此，考察重組酶的最適溫度及穩定性，結果見圖2。由圖2可知，AcPase最適催化溫度為 65 ℃。溫度從30 ℃升高到65 ℃時，該重組酶活性隨溫度逐漸升高;當達到80 ℃時，酶活性損失達63%。重組酶(3 g/L)在45、55和65 ℃的半衰期分別為17.4、6.3和2.7 h，而且隨著溫度升高和處理時間的延長，該酶活衰減較快。由此可知，雖然重組酶的最適催化溫度為65 ℃，但在此溫度下，酶的熱穩定性較差。

圖2 AcPase的最適溫度和溫度穩定性Fig.2 Optimal temperature and thermostability of AcPase

2.3.2 重組酶的最適pH

在pH為4.0～8.0時測定AcPase的最適pH，結果如圖3所示。由圖3可知:該重組酶在酸性環境下具有較大的催化活性，其最適pH為6.0;當pH大于7.0時，酶活力迅速降低。同時該酶對不同緩沖液具有選擇性:在pH 6.0下，MOPS緩沖液中的酶活力是乙酸-乙酸鈉緩沖液中的1.8倍;在pH 7.0下，MOPS緩沖液中的酶活力是HEPES緩沖液的1.1倍。由此可見，該重組磷酸酶在pH 6.0的MOPS緩沖液中酶活最高。

圖3 pH對AcPase酶活力的影響Fig.3 Effects of pH on the specific activity of AcPase

2.3.3 不同金屬離子對重組酶活性的影響

金屬離子會對HAD家族水解酶蛋白結構域環4(loop 4)上的羧酸殘基及環4位置在調節酶活性方面產生影響[18]，且多數磷酸酶需要金屬離子的激活作用，其中，Mg2+、Mn2+對酶活性的影響最為顯著。因此，考察重組磷酸酶對各種金屬離子的依賴性，結果如圖4所示。

由圖4可知：在5 mmol/L Mg2+的環境中，AcPase展現出最高酶活性，是未加任何離子反應體系的21倍；Co2+、Mn2+、Ni2+可分別提高酶活性11、5.3和4.7倍；Zn2+對該酶活性無明顯的影響。然而，Cu2+、Fe3+和Ca2+具有抑制酶活性的作用，殘余酶活力分別保持在62%、40%和30%，其中Fe3+和Ca2+嚴重影響酶活性且會造成酶發生沉淀。

圖4 金屬離子對AcPase酶活力的影響Fig.4 Effects of metal ions on the specific activity of AcPase

2.3.4 重組酶的動力學分析

針對酶活性較高的3種磷酸糖進行動力學參數的測定，結果如表3所示。由表3可知，該重組酶以G6P、G1P和F6P為底物時的米氏常數(Km)分別為8.9、17.57和7.47 mmol/L。因此，相對于G1P，AcPase對G6P和F6P展現出較高的底物親和力。該重組酶對底物的轉換數(kcat)分析顯示，AcPase對G6P的Kcat值為1.65 s-1，分別是G1P和F6P的1.96倍和2.95倍。盡管AcPase對G6P的底物親和力稍低于F6P，但是該酶對G6P的高轉換常數導致AcPase對G6P具有最高的催化效率(kcat/Km)。AcPase對G6P的底物催化能力分別是對F6P和G1P的2.5和4倍，這與該酶的比酶活測定結果相一致。因此，AcPase是一個廣泛底物特異性的磷酸酶，同時表現出良好的葡萄糖-6-磷酸酶活性。

表3 AcPase的動力學參數

2.4 重組酶的應用

纖維素是地球上最豐富的可再生資源，被認為是生產生物燃料和生物基化學品的重要原料。目前，纖維素的利用研究通常通過多酶(內切纖維素酶、外切纖維素酶、纖維二糖水解酶)協同水解生成葡萄糖，進而經微生物發酵生產生物基化學品[19]。然而，外切纖維素酶和纖維二糖水解酶通常會受到產物的嚴重抑制，因此，傳統的纖維素水解方法很難將纖維素完全轉化為葡萄糖。根據對AcPase的酶學性質分析，該酶可被引入體外多酶系統，通過底物磷酸化、中間產物異構化、脫磷酸反應，從而避開產物抑制。

因此，筆者構建了從經預處理后的纖維素轉化葡萄糖的體外多酶催化系統，如圖5所示，該途徑包括4個酶催化的連續反應步驟：①在磷的存在下，多糖磷酸化酶(CDP)使纖維多糖磷酸化，生成纖維二糖和葡萄糖-1-磷酸；②在磷的存在下，纖維二糖磷酸化酶(CBP)磷解纖維二糖，生成葡萄糖(Glc)和葡萄糖-1-磷酸；③在磷酸葡萄糖變位酶(PGM)催化下，葡萄糖-1-磷酸轉化為葡萄糖-6-磷酸；④通過磷酸酶(AcPase)將葡萄糖-6-磷酸去磷酸化為葡萄糖，生成的磷供應反應①②，從而使得整個系統磷平衡。

圖5 纖維多糖轉化葡萄糖的途徑Fig.5 Scheme of pathway for the conversion of cellodextrins to glucose

在纖維素生物轉化葡萄糖反應中，選用的CDP、CBP、PGM和AcPase，在50 ℃、0.1 mol/L MOPS緩沖液(pH 6.0)條件下，測定的比酶活分別為0.66、30、50和0.68 U/mg。

利用AcPase轉化5 g/L纖維多糖進行葡萄糖的生物合成，結果如圖6所示。由圖6可知：反應的前1 h，產物的生成速率最快，但隨著底物的消耗，產率的增長逐漸變緩慢；反應5 h后，預處理的5 g/L纖維多糖(DP=2.9，25 mmol/L葡萄糖)成功轉化為24.4 mmol/L葡萄糖，產率達到97.6%。因此，該熱穩定性的AcPase實現了纖維素到葡萄糖的完全轉化，為將來工業上纖維素的利用提供了堅實的研究基礎。

圖6 使用5 g/L纖維多糖進行葡萄糖的生物合成Fig.6 Biosynthesis of glucose from 5 g/L cellodextrins

3 結論

以解纖維素熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)基因組中HAD超家族的磷酸酶基因為基礎，通過E.coli密碼子偏愛性優化后得到新的磷酸酶基因AcPase，并成功在E.coliRosetta (DE3)中進行異源表達，經過His Trap HP樹脂柱純化獲得純酶。AcPase屬于Mg2+依賴型的HAD磷酸酶并具有廣泛的底物譜。經酶學性質分析，以D-葡萄糖-6-磷酸為底物時，在45～65 ℃、pH 6.0～7.0的MOPS緩沖液中表現出相對高的酶活力和熱穩定性。在“一鍋法”將纖維素生物轉化為葡萄糖的研究中，實現葡萄糖產率達到97.6%，與傳統纖維素利用纖維素酶進行水解方式相比，該研究為纖維素完全轉化提供了新的研究思路。