microRNA-192在結直腸癌中的表達及意義

周嬋 姜林輝 盧碧燕 冼麗英 袁錦玉

1)南方醫科大學附屬東莞醫院 東莞 523000 2)廣東東莞職業技術學院 東莞 523000

結直腸癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤之一。根據世界衛生組織下屬的國際癌癥研究機構(IARC)發布的全球癌癥統計數據(GLOBOCAN 2020)，預計2020年全球新增結直腸癌患者約193萬，死亡人數約93.5萬[1]。早期結直腸癌患者的預后相對較好，但是對于中晚期患者，即使接受手術、放化療、新型靶向及免疫治療，5 a生存率仍僅為50%～60%。結直腸癌的發生和進展是一個復雜的病理過程，涉及多種信號通路的調節。微小RNA(microRNA)屬于內源性非編碼單鏈RNA，與人類多種疾病密切相關[2-3]。本研究擬檢測microRNA-192在結直腸癌、腺瘤和增生型息肉中的表達情況，探討其與結直腸癌的臨床病理因素的相關性，利用脂質體轉染技術上調microRNA-192的表達，觀察腸癌細胞株增殖和遷移能力變化。

1 資料與方法

1.1一般資料收集我院2010-01—2014-12病理科存檔的結直腸癌標本45例，腺瘤25例，增生性息肉25例。所有入組的結直腸癌病例臨床資料完整，術前均未行放化療、靶向或免疫治療，并經組織病理學證實為浸潤性腺癌。結直腸癌的分期參照美國癌癥聯合委員會和國際抗癌聯盟共同制訂的結直腸癌TNM分期系統(2010年第七版)。本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2方法熒光定量PCR檢測microRNA-192的表達：常規切片蘇木素-伊紅染色，在顯微鏡下選取代表性區域，8 μm厚度切片5張。使用北京天根生物科技有限公司生產的石蠟包埋組織切片總RNA提取試劑盒(DP439)提取總RNA。根據miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA。PCR反應條件：95 ℃起始模板變性15 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸34 s，共45個循環。通過熔解曲線對擴增產物進行分析并相對定量。CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況：將各組細胞以1×105/孔的濃度分別接種于96孔板，每組設5個復孔，在不同時間點加入CCK-8工作液(10 μL/孔)，置于37 ℃、5% CO2的培養箱避光繼續培養2 h，使用Model 680酶標儀在波長450 nm處測定吸光度值。Transwell小室裝置檢測細胞遷移能力：化學合成microRNA-192模擬物及陰性對照，利用LipofectamineTM 3 000試劑進行轉染。各組細胞在轉染48 h后使用胰酶消化，并用無血清培養基重懸制成1×105/mL的細胞懸液，取200 μL加入上室，在下室中加入800 μL含10%胎牛血清的培養基，置于培養箱中繼續培養36 h，去除上室細胞，用4%甲醛固定10 min，臺盼藍染色，顯微鏡下隨機選取5個400倍視野計算遷移細胞數目。

2 結果

2.1microRNA-192在不同組織中的表達情況熒光定量PCR檢測結果顯示，microRNA-192在結直腸癌中的表達水平低于結直腸腺瘤和增生性息肉(P<0.05)。見圖1。

圖1 microRNA-192對腸癌細胞株LoVo增殖和遷移能力的影響

2.2microRNA-192表達與臨床病理參數的相關性在45例結直腸癌患者中，microRNA-192的表達水平與是否發生淋巴結轉移相關(P<0.05)；而與患者的年齡、性別、腫瘤分級等無明顯相關性(P>0.05)。

2.3microRNA-192對腸癌細胞增殖和遷移的影響CCK-8試劑盒和Transwell小室裝置分別檢測細胞增殖活性和遷移能力，結果顯示，microRNA-192對人腸癌細胞株LoVo的生長和遷移均具有抑制作用(P<0.05)。見圖2、圖3。

圖2 microRNA-192對腸癌細胞株LoVo增殖活性的影響

圖3 microRNA-192對腸癌細胞株LoVo遷移能力的影響

3 討論

結直腸癌是臨床上常見的消化系統惡性腫瘤。近年來，隨著社會經濟的飛速發展和人口老齡化日漸加劇，結直腸癌的發生率亦呈持續上升的態勢。據國家癌癥中心新近發布的癌癥發病與死亡統計數據估算，2015年我國新發結直腸癌病例數達38.76萬[4]。鑒于我國人口基數龐大，結直腸癌已逐漸成為重大的疾病負擔。盡管已有相關研究揭示了包括APC、KRAS、BRAF等基因突變在結直腸癌的發生、發展中發揮重要的作用，但僅有基因突變理論仍不足以闡釋結直腸癌多樣的生物學行為。表觀遺傳學異常尤其是DNA甲基化以及微小RNA、環狀RNA等非編碼RNA調控修飾在腫瘤惡性演進等方面的研究，近年來受到越來越多的關注。

microRNA是在生物體內普遍存在的一類具有重要調控功能但不編碼蛋白質的短序列RNA。大量研究已經證實，microRNA可動態調節細胞分化、增殖、凋亡、遷移，參與生長發育、免疫應答和腫瘤發生等多種病理生理過程[5-6]。microRNA-192編碼基因定位于人類染色體11q13.1位點。microRNA-192在消化道、腎臟和胸腺等正常組織中具有較高水平的表達。microRNA-192的表達失調與腎癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發生密切相關。Lokeshwar和Khella 等[7-8]研究發現，在腎細胞癌腫瘤組織中microRNA-192表達較正常組織顯著下調，過表達microRNA-192可抑制腎癌細胞的侵襲和遷移能力。在本研究比較了microRNA-192在結直腸癌、腺瘤和增生性息肉中的表達差異，發現microRNA-192在結直腸癌中的表達水平低于結直腸腺瘤和增生性息肉；在結直腸癌患者中，microRNA-192的表達水平與患者是否發生淋巴結轉移相關；而與患者的年齡、性別、腫瘤分級等參數無明顯的相關性；體外細胞實驗證實，microRNA-192抑制人腸癌細胞株LoVo的生長和遷移。

綜上所述，microRNA-192在結直腸癌中呈低表達狀態，且與腸癌細胞生長和遷移相關，有可能成為抗腫瘤治療的潛在靶點。microRNA-192具體作用機制仍然有待深入研究。