禽源NME/NM23核苷二磷酸激酶2(NME2)基因的克隆及表達鑒定

謝麗基，謝芝勛，王盛，黃嬌玲，鄧顯文，謝志勤，羅思思，曾婷婷，張艷芳，張民秀，范晴

(廣西壯族自治區獸醫研究所/廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001)

禽呼腸孤病毒(ARV)主要引起家禽的病毒性關節炎/腱鞘炎、矮小綜合征及吸收不良綜合征等，尤為嚴重的是誘發免疫抑制，造成家禽對疫苗免疫應答能力和各種病原體抵抗力降低。σA蛋白是禽呼腸孤病毒S2基因編碼的結構蛋白，能激活PI3K-AKT信號通路的作用[1]，與禽呼腸孤病毒抗干擾素作用有關[2]，在ARV的感染致病過程中發揮重要作用。本課題組在前期的免疫共沉淀(CO-IP)、質譜鑒定以及酵母雙雜交篩選的研究中發現，禽源NME2是潛在的與禽呼腸孤病毒 σA 蛋白互作的宿主蛋白[3]。

NME(non-metastasis cells)基因即NM23基因，是Steeg等[4]學者從7株轉移能力不同的小鼠黑色素瘤細胞系中，用差示雜交的方法蹄選鑒定出的一種與腫瘤轉移抑制相關的基因，他們將此基因命名為NME基因。迄今為止，已發現屬于基因家族的有10種，它們分別是到NME1到NME10[5]。二磷酸核苷激酶(nucleoside diphosphate kinase，NDPK)活性是NME家族共同的特征[6]，其中，NME2(NME/NM23核苷二磷酸激酶2)編碼的NDPK的B亞基，具有核苷二磷酸激酶活性，催化二磷酸核苷轉化為相對應的三磷酸核苷[7]，參與細胞的的能量代謝[8]、微管解聚[9]等過程，影響腫瘤的浸潤和轉移。

因此，本研究構建禽源NME2基因的真核表達重組質粒pEF1α-Myc-NME2，為后續進一步驗證宿主蛋白NME2是否與禽呼腸孤病毒σA相互作用，并研究其對σA基因功能的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試驗試劑

RT-PCR試劑盒、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、PrimeScript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit、pEF1α-Myc載體和限制性內切酶SalⅠ和NotⅠ購自寶日醫生物技術(北京)公司；T4 DNA連接酶和質粒提取試劑盒購自Promega公司；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent購自Invitrogen 公司；Anti-Myc tag Mouse mAb購自Cell Signaling Technology公司；山羊抗鼠IgG (FITC)購自Abcam 公司；堿性磷酸酶標記的山羊抗鼠IgG購自碧云天公司。

1.2 引物的設計與合成

根據GenBank中禽源NME2基因序列(登錄號：NM_205047.1)，設計合成了1對特異性引物(表1)，引物序列的斜體標記為酶切位點(EcoRⅠ和NotⅠ)。

表1 引物序列

1.3 NME2基因的克隆

1.3.1 RT-PCR擴增NME2基因

提取雞胚成纖維細胞傳代系(DF-1)的RNA，使用PrimeScript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit反轉錄成cDNA，并用表1中的特異性引物，對NME2基因進行PCR擴增。

1.3.2 NME2基因的克隆

將50 μL PCR產物電泳后，切膠后用DNA片斷膠回收試劑盒純化回收。將純化PCR產物克隆至pMD-18T載體，得到pMD-18T-NME2重組菌。抽提重組菌及空載體pEF1α-Myc的質粒，分別用限制性內切酶EcoRⅠ和NotⅠ同時進行雙酶切，酶切產物切膠回收后，用T4 DNA連接酶連接轉化到 DH5α 感受態細胞中，得到pEF1α-Myc-NME2重組菌。對重組菌進行PCR檢測、雙酶切驗證，并送深圳華大基因科技服務有限公司進行測序驗證。

1.4 NME2基因的表達

1.4.1 轉染細胞

參照無內毒素質粒大量提取試劑盒說明書，大量提取質粒(pEF1α-Myc、pEF1α-Myc-NME2)，-20 ℃保存備用。參照脂質體轉染試劑盒使用說明書，將質粒分別轉染長成單層的DF1細胞(6孔板)，同時設立陰性細胞組(未轉染質粒)。

1.4.2 間接免疫熒光和Western blot檢測NME2的表達

細胞轉染24 h后棄掉培養液，用PBST洗滌3次，用預冷的甲醇和丙酮混合溶液于冰上固定細胞10 min，用PBS(4 ℃預冷)洗滌3次。在pEF1α-Myc、pEF1α-Myc- NME2轉染的細胞中加入Anti-Myc tag Mouse mAb(1∶1 000稀釋)，37 ℃作用2 h。棄去細胞板中的一抗，用PBS(4 ℃預冷)輕洗細胞5次，加入FITC標記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，37 ℃避光作用1.5 h。棄去細胞板中的二抗，用PBS(4 ℃預冷)輕洗細胞5次，熒光顯微鏡觀察結果。

同時，收集轉染后的DF1細胞，參考文獻[10]的方法，使用Anti-Myc tag Mouse mAb和堿性磷酸酶標記的山羊抗鼠IgG，對目的蛋白NME2進行Western blot檢測。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的PCR鑒定及測序

通過菌液PCR對所構建的真核表達重組質粒pEF1α-Myc-NME2的陽性克隆進行篩選。如圖1所示，NME2擴增的基因片段大小為462 bp，與預期大小相符。測序結果也證實了pEF1α-Myc-NME2重組質粒的正確性。

2.2 重組質粒的雙酶切驗證

真核表達重組質粒pEF1α-Myc- NME2的雙酶切鑒定結果見圖2。重組質粒pEF1α-Myc-NME2雙酶切后，得到4 622 bp的載體條帶和462 bp的NME2基因條帶，說明NME2基因已經正確插入到表達載體pEF1α-Myc。

M.Trans DNA Marker；1、2.pEF1α-Myc-NME2圖1 真核表達重組質粒的PCR鑒定

M.Trans2K Plus DNA Marker；1.pEF1α-Myc-NME2圖2 真核表達重組質粒的雙酶切驗證

2.3 間接免疫熒光檢測目的蛋白的表達

如圖3所示，在熒光顯微鏡下，真核表達重組質粒pEF1α-Myc-NME2轉染組的DF1細胞均可觀察到綠色熒光的出現，而分別以鼠源Myc標簽抗體為一抗的陰性對照組則無綠色熒光的出現。

A.陰性對照；B.pEF1α-Myc-NME2圖3 間接免疫熒光檢測結果

2.4 Western blot檢測目的蛋白的表達

如圖4所示，真核表達重組質粒pEF1α-Myc-NME2表達的Myc-NME2融合蛋白在大約19.4 kDa處有單一的目的條帶，而陰性對照組沒有條帶。

M.蛋白Maker；1.陰性對照；2.pEF1α-Myc-NME2圖4 Western blot檢測目的基因的表達

3 討論

NME2參與多種細胞活動，包括細胞增殖、生長、黏附和分化[11]。NME2 蛋白對于細胞凋亡也發揮重要作用。研究表明，NME2 蛋白作為Diva和Bcl2- L-10特異性結合蛋白，在細胞凋亡過程中發揮新的生物學功能[12-13]。NME2蛋白的過量表達能夠誘導凋亡。Xiao等[14]研究報道，高表達量的NME2蛋白能夠和TIP30轉移抑制因子協同促進細胞凋亡；NME2蛋白的缺失引起Diva性凋亡活動的增加[15]。

本課題組在前期的CO-IP、質譜鑒定以及酵母雙雜交的研究中，發現了禽源NME2基因蛋白是潛在的、與禽呼腸孤病毒σA蛋白互作的宿主蛋白[3]。為進一步的驗證，需要將NME2基因克隆到真核表達載體，并與禽呼腸孤病毒 σA基因的重組質粒共同轉染細胞，進行雙向CO-IP和Western blot，驗證NME2與禽呼腸孤病毒σA的相互作用。因此，本研究選定禽源NME2基因，分別設計了特異性引物進行RT-PCR擴增、雙酶切和克隆，構建了宿主蛋白NME2的真核表達重組質粒，并命名為pEF1α-NME2。本研究構建重組質粒，所選用的真核表達載體pEF1α-Myc帶有Myc標簽，Myc這種標簽的分子量較小，對后續表達的外源靶蛋白空間結構影響小，不會對蛋白質的功能產生影響。

本研究將真核表達重組質粒pEF1α-NME2轉染DF1細胞后，經間接免疫熒光和Western blot兩種方法，驗證了Myc-NME2融合蛋白的正確表達，為后續進一步驗證禽源宿主蛋白NME2是否與禽呼腸孤病毒σA蛋白相互作用奠定基礎。