基因2型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的遺傳變異與演化

張振東，曲向陽，徐孝宙，邢軍*

(1.江蘇科技大學生物技術學院，江蘇 鎮江 212018；2.南京博維特健康管理有限公司，江蘇 南京 211800；3.江蘇農林職業技術學院，江蘇 鎮江 212400)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種以母豬的繁殖障礙、生長豬的呼吸道疾病以及感染豬的繼發感染為主要癥狀的重要疫病。從全球范圍看，除澳大利亞、新西蘭、瑞士、挪威、芬蘭和瑞典等國家無PRRS疫情外，其他養豬生產國家均無一幸免。PRRS在我國習慣被稱為“豬藍耳病”，疫情更為復雜。

PRRSV是一種呈球形、有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子大小為60～65 nm，全長基因組約15 kb。2016年，國際病毒學分類委員會(ICTV)將PRRSV、小鼠乳酸脫氫酶病毒(mouse lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV)和大鼠動脈炎病毒1(rat arterivirus 1)歸為套式病毒目(Nidovirales)動脈炎病毒科(Arteriviridae)豬動脈炎病毒屬(Porartevirus)，基因1型和2型PRRSV也被重新定為2個種，分別稱為PRRSV1和PRRSV2[1]，我國主要以PRRSV2的流行為主。PRRSV極易變異與重組，宿主的天然免疫和特異性免疫因素，以及其他篩選壓力加速了病毒核苷酸的突變，而當兩株或多株病毒同時感染同一宿主時又可發生高頻率的重組。此外，PRRSV異源毒株間交叉保護性差，變異毒株、演化毒株及重組毒株等新毒株的出現往往導致新疫情的流行。因此，自20世紀80年代出現以來，PRRSV的分子流行病學和遺傳變異問題一直是關注的熱點，本文就PRRSV 2毒株在遺傳演化方面的研究進展進行了綜述，以期為PRRS的免疫防控提供參考依據。

1 PRRSV2的遺傳演化與多樣性

1.1 PRRSV2自然流行毒株的變異與演化

PRRSV2于1987年在北美北卡羅來納州首先暴發后，隨即迅速在北美洲地區廣泛流行并傳播至其他國家和地區。1992年，Benfield等[2]從組織病料中首次分離到原型毒株VR-2332。隨后在亞洲一些國家或地區也相繼暴發PRRS疫情并分離到PRRSV毒株，且多與北美地區的分離株高度同源，這說明疫情的暴發極有可能與從疫區引進種豬或其他相關產品的進出口貿易有關[3]。PRRSV暴發后在各個國家和地區進行著獨立的變異和演化，大量的PRRSV序列和毒株被檢測以及分離。Shi等[4]基于8 624個ORF5基因序列進行了PRRSV2的遺傳演化分析，該結果得到了大家的認可并被廣泛引用。在該分析中PRRSV2被劃分為9個譜系(lineage)，相鄰譜系間的遺傳演化距離至少為10%以上，超過85%的序列分布于4個大的譜系，即：譜系1、5、8和9，剩余毒株分布于5個小的譜系，譜系內又根據演化距離7%為閾值劃分為不同的sub-lineage，比如譜系8和9分別包括9個和17個sub-lineages。PRRSV2原型毒株VR-2332、中國BJ-4、韓國PL97-1以及丹麥等國家早期分離株屬于譜系5[3,5]，該譜系毒株最具“國際范”，在多個國家和地區流行，這可能與疫苗毒Resp/PRRS MLV在全球范圍內的廣泛使用有關。加拿大的早期分離毒株IAF-EXP91屬于譜系1[4,6]，該譜系在系統發育樹中位于根的位置且其中的毒株大部分來自加拿大的魁北克，而目前記錄的最早的PRRSV陽性血清發現地也是位于加拿大，因此普遍認為PRRSV2起源于加拿大。1996年，泰國學者第一次在其國內分離到PRRSV2毒株，其與IAF-EXP91同源關系最近，屬于譜系1。美國明尼蘇達州出現以nsp2存在131個氨基酸不連續缺失為特征的變異株MN184[8]，進化樹分析其屬于譜系1，推測其是加拿大譜系1傳入后的變異演化株。Brockmeier等[9]報道了演化于MN184的高毒力毒株NADC30，該毒株分離于2008年并于2013年開始傳入中國[10]，造成了我國PRRS新疫情的發生和再度流行。最新研究發現，NADC30-like毒株已經在韓國出現并流行[11]。1996年夏天，美國暴發嚴重型PRRS[12]，分離毒株屬于譜系8和9，而中國1996年首次分離到的PRRSV毒株CH-1a同樣屬于譜系8，這是否與美國暴發的嚴重型PRRS有關值得探討。隨后，在一段相當長的時間內，中國PRRSV分離株以譜系8為主，包括2006暴發的以nsp2高變區30個氨基酸缺失為特征的HP-PRRSV，HP-PRRSV流行于東南亞地區的[13]。譜系9毒株主要流行于美國、日本、墨西哥和意大利等地區，包含了當時數據庫中大部分的PRRSV序列(2 800/8 624)。臺灣分離株MD-001、中國分離株FJ-1以及香港地區擴增到的部分PRRSV序列屬于譜系3。2005年之后基本上未分離到該譜系毒株，但近年來中國東南部地區重新出現譜系3毒株，并具有小范圍流行趨勢[14]。譜系2、4、6和7內的毒株數量少，曾在不同的地區散發流行，近年來未見有關這幾個譜系內毒株的文獻報道。2013年美國出現ORF5 RFLP 1-7-4(NADC34)分支的PRRSV毒株并正在多個地區流行[15]，其以nsp2編碼區100個氨基酸的連續缺失為特征，2017年下半年，我國分離到NADC34-like毒株[16]。

1.2 PRRSV2疫苗毒株及重組毒株的變異與演化

常用的PRRSV2減毒活疫苗(MLV)有“Resp/PRRS”(親本毒株為VR-2332，譜系5)、“ATP”(親本毒株為JA142，譜系8)、“CH-1R”(親本毒株為CH-1a，譜系8)、“R98”(親本毒株為R98，譜系5)、“HP-PRRSV MLV”(親本毒株為HP-PRRSV，譜系8)以及于2000年退出市場的“PrimePac”(親本毒株為Neb-1，譜系7)。在丹麥使用過Resp/PRRS減毒活疫苗的豬場暴發PRRS疫情，從弱仔和死亡豬只中分離到的毒株與疫苗毒高度同源，這也是歐洲地區的第一個PRRSV2案例[17]；同時，從丹麥地區未免疫過PRRSV疫苗的豬場分離到毒株DK-1997-19407B，該毒株與疫苗毒Resp/PRRS的全基因組核苷酸同源性高達99.4%[18]，而Kvisgaard等[19]對丹麥地區15年內分離到的PRRSV2毒株進行分析，發現多數與疫苗毒有關，這說明PRRSV疫苗毒不僅可以返強，而且會在一個地區內廣泛的傳播和流行。另外，意大利、澳大利亞、波蘭以及匈牙利等多個國家也分離到PRRSV2的疫苗演化毒株[17,20-21]。1998年美國愛荷華州一未免疫豬場暴發PRRS疫情，經研究分析證實，該疫情是由Resp/PRRS疫苗返強毒株98-37120-2引起[22]。在我國，從未使用過HP-PRRSV弱毒苗的豬場分離到3株JXA1-P80的返強毒株NT1、NT2和NT3[23]，Yu等[24]2014年分離株JX2014T2全基因組核苷酸同源性與TJ野毒株高度同源，且其nsp2區域存在TJM-F92特有的120個氨基酸缺失，說明JX2014T2為TJM-F92的返強毒株，而Zhang等[25]從一個豬場也分離到了兩種疫苗毒HuN4-F112和TJM-F92的演化毒株HeN1201與HeN1301。

1996年，Kapur等[26]在對田間10個分離株橫跨ORF2-7的片段進行分析時，第一次發現并報道了PRRSV2田間毒株的重組現象。Yuan等[27]在細胞水平上證實了PRRSV2可發生較高頻率的重組而產生新的病毒。隨后，來自美國、墨西哥以及中國等多個國家和地區的專家學者檢測到了PRRSV2重組現象的發生[28-30]，但絕大多數都是基于ORF5序列的分析，真正分離到的重組病毒并不多見，這可能與親本病毒更強的競爭優勢有關[27]。Li等[31]從發病仔豬身上分離到了疫苗毒株CH-1R和高致病性毒株WUH1的重組毒株Em2007，這是PRRSV2疫苗毒株與田間毒株發生重組的首次報道。Shi等[28]研究發現，2009至2010年中國高致病毒株的再次流行就是源于HP-PRRSV與經典毒株的重組。對全球范圍內PRRSV毒株的系統分析，也進一步證實了重組是發生于PRRSV毒株間的一個普遍現象。將同屬于PRRSV2譜系8的兩個毒株JXwn06-81c和HB-1/3.9c共感染豬，結果表明兩毒株在豬體內可發生重組，且重組模式多樣和復雜[32]。早期報道的重組基本上是發生于同譜系內的毒株或者說具有高度同源性的兩個親本毒株之間，鮮有報道不同譜系毒株或者說同源性偏低毒株的重組現象。Lu等[33]分析發現，GM2是由野外新流行毒株QYYZ(譜系3)與疫苗毒株Resp/PRRS(譜系5)的重組病毒。NADC30毒株(譜系1)2013年傳入中國，其表現出了與我國毒株極易重組的特性，尤其是與疫苗毒或疫苗演化毒(譜系8的HP-PRRSV MLV，譜系5的Resp/PRRS MLV)，這可能與PRRSV減毒活疫苗在我國的廣泛使用有關。大量的重組毒株被分離報道，甚至出現了三四個譜系等多譜系毒株重組的現象，重組模式亦越發復雜[10,34]。

2 我國PRRSV的遺傳演化與多樣性

PRRS最早在我國臺灣地區暴發，1991、1992年先后分離到毒株MD001和WSV。WSV與PRRSV2原型毒株VR-2332高度同源，屬于譜系5；而MD001進化樹上形成獨立的分支，屬于譜系3。基于MD001和WSV兩個原型毒株，臺灣地區PRRSV主要分布于兩個群體且以MD001群體為主[35]。在大陸地區，我國動檢部門在1995年從加拿大引進的種豬中檢測到了PRRSV抗體陽性豬[3]，郭寶清等[36]率先從發病豬場流產胎兒樣本中分離到毒株CH-1a，隨后，楊漢春等[5]分離到BJ-4。雖然CH-1a最早被分離，但其全基因組序列與VR-2332差異較大，該毒株是否發源于我國、或是由其他國家和地區傳入尚無定論，但學者普遍將其歸為我國的本土毒株。BJ-4與VR-2332高度同源，屬于譜系5，進化樹上其與VR-2332的疫苗毒株RespPRRS親緣關系更近，推測該毒株是由引進疫苗免疫種豬、私自使用減毒活疫苗或者其他相關產品的貿易活動而傳入我國。自上世紀90年代出現以來，PRRSV在2～3年內便迅速傳播至我國各個地區，并在復雜的環境中進行著變異與演化[37]。Gao等[38]從河北地區分離到兩株CH-1a的演化毒株HB-1(sh)/2002和HB-2(sh)/2002，其中HB-2(sh)/2002的nsp2和GP3區域分別存在12個和1個氨基酸的缺失，這是我國首次分離到的基因組天然缺失毒株。2004年分離毒株NB/04的nsp2編碼區存在1個氨基酸的缺失(第481位)。2006年，我國豬群出現以高熱、高發病率和高死亡率以及妊娠母豬嚴重的繁殖障礙為特征的HP-PRRSV，其nsp2編碼區存在不連續的30個氨基酸缺失(第481位，531-561位)[39]，雖然Zhou等[40]已經證實該缺失與其致病力無關，但該特征作為HP-PRRSV的分子標志常被用來進行流行病學調查。此后數年內，HP-PRRSV及其演化毒株成為了我國田間的主要優勢流行毒株。

據Han等[41]研究報道，自2006年HP-PRRSV暴發以來，我國的PRRS疫情可分為3個流行階段。2006至2008年以最初暴發的具有高同源性的HP-PRRSV為主，2007年到達流行的高峰。Li等[42]人的研究進一步證實了該結果，其發現2007年629分樣品中HP-PRRSV的檢出率高達64.86%，而未檢測到經典毒株。第二階段為2009至2012年，PRRSV毒株之間的重組活動導致了疫情的再度流行[28]，并且自該時期開始PRRSV變異與演化的速率呈現出明顯加快的趨勢，特別是nsp2編碼區不同缺失、插入及突變類型的新毒株和重組毒株的出現，可能與HP-PRRSV減毒活疫苗的逐步推廣使用有關。2013年以來為第三階段，近年來HP-PRRSV似乎已經“銷聲匿跡”，生產中由其引起的疫情已不多見，取而代之的是散發的病例和一些亞臨床感染，分離到的毒株多數是HP-PRRSV疫苗毒、疫苗演化毒株及其與NADC30-like毒株的重組毒株[25,34]。2017年下半年，我國分離到nsp2編碼區100個氨基酸的連續缺失為特征NADC34-like毒株[17]，其是否會造成新的流行，需要我們的不斷監測和持續跟蹤。以QYYZ為代表的PRRSV2譜系3毒株自2010年開始在我國東南部地區重新流行并有擴大范圍之勢，近年來該譜系的分離毒株越來越多[33]。另外，據Gao等[43]的認為，2011年在我國新疆地區首次出現屬于譜系9的毒株，在進化樹上形成獨立的小分支。

為控制我國暴發的HP-PRRSV，自2011年以來，多種HP-PRRSV減毒活疫苗(JXA1-P80、HuN4-F112、TJM-F92以及GDr180)被開發和廣泛使用[44-47]，雖然對PRRS的防控起到了一定的作用，但由于人們對疫苗的過分依賴及無序使用，導致了疫苗毒在田間的持續流行和傳播，甚至出現了疫苗毒返強的現象，增加了不同毒株間重組的可能性，致使我國PRRS疫情更為復雜[41]。Jiang等[26]和Yu等[27]從豬場分離到的JXA1-P80和TJM-F92的返強毒株對仔豬具有致死性毒力。同譜系、不同譜系以及多個譜系之間的重組毒株越來越多，尤其是疫苗毒及其演化毒株與自然野毒株或新傳入毒株的重組現象值得特別關注。

3 展望

開展PRRSV分子流行病學研究，深入探討和揭示PRRSV的遺傳演化規律，對PRRS的提前預警和及時防控具有非常重要的意義。由于毒種的多樣性、RNA病毒聚合酶的低保真性、免疫壓力，以及病毒之間的相互重組等多方面的的因素，PRRSV具有廣泛變異和快速演化的能力，變異株、新毒株層出不窮，30多年來，大量的PRRSV毒株被分離。此外，PRRSV減毒活疫苗在發揮其保護作用的同時也表現出了明顯的負面影響，疫苗返強毒株時有報道，而“鋪天蓋地”式的免疫策略使豬場內病毒的本底加大，進而導致疫苗毒株或疫苗演化毒株與自然野毒株之間的重組幾率大大增加，重組毒株越來越多。因此，盲目使用、過分依賴減毒活疫苗只能是一種惡性循環，這也十分不利于PRRSV的凈化工作。對于PRRS的防控，重視豬場的內外部生物安全仍是根本之策，合理使用疫苗(陰性場不使用疫苗，一個場僅使用一種疫苗等)，加強引種時的隔離檢測，適當采取活毒馴化、閉群、清群和種群更新等控制措施，減少PRRSV的傳播、延緩變異與演化的速度，從而降低疫情發生的概率。