復合微生物菌劑在豬糞無害化處理中的應用

邵栓，朱群，李慧娟，常娟，王平，劉超齊，尹清強*

(1.河南農業大學牧醫工程學院，河南 鄭州 450002；2.瑪納斯縣農業農村局，新疆 昌吉 832200；3.河南德鄰生物制品有限公司，河南 新鄉 453000；4.河南省鄭州種畜場，河南 鄭州 450011)

隨著我國畜牧業向規模化和集約化的不斷發展，大量未經處理直接排放的畜禽糞便給環境造成了嚴重污染[1-3]。因此，如何加快促進畜禽糞便無害化、減量化和資源化利用，已經成為畜牧業發展迫切需要解決的重要問題。由于畜禽糞便中氮、磷、鉀及微量元素含量豐富，因此畜禽糞便堆肥化處理是解決畜禽糞便資源化利用的最有效途徑[4-5]。傳統的堆肥化處理由于堆肥周期長，不能有效控制堆肥過程中產生的臭氣和病原菌，限制了其在規模化養殖場的推廣應用[6]。高溫好氧堆肥化處理，由于其對糞便中有機物分解速度快、最大程度地減少臭氣排放及殺滅病原菌等優點，已成為當前畜禽糞便資源化利用中的一項重要研究內容[7]。高溫好氧生物堆肥化處理是將各種堆肥原料按一定比例混合后，控制一定的堆肥條件，依靠微生物之間的相互作用,通過高溫發酵分解有機物轉變為肥料的技術[8]。

大量研究發現，在堆肥中加入功能性微生物菌劑，能相對延長堆肥高溫持續時間，控制惡臭氣體的轉化，降低堆肥中的養分損失，改善堆肥微生物菌群組成。岳丹等[9]發現，有纖維素降解功能復合菌劑能降低堆肥中纖維素含量，提高豬糞堆肥期發酵溫度，縮短堆肥周期。孫旭等[10]報道，復合菌劑能顯著提高豬糞堆肥產品中速效氮、速效磷、速效鉀含量。徐杰等[11]發現，有快速升溫除臭功能的復合菌劑可以明顯降低雞糞堆肥過程中臭氣濃度，降低堆肥中氮素損失，快速有效分解纖維素等有機物質。張生偉等[12]研究表明，與自然堆肥相比，在加入除臭功能復合菌劑的豬糞和雞糞堆肥中，氮元素損失分別降低了25.84%和28.65%，同時都能促進硫元素向無機硫形式轉化，減少惡臭氣體排放。徐瑩瑩[13]發現，有木質纖維素降解能力的復合菌劑能促進堆肥有機質分解，減少堆肥中反硝化細菌數量。由于糞便堆肥發酵的菌種配伍、原料組合及發酵工藝等方面存在一些問題，本試驗通過控制堆肥含水率，選擇適宜除臭功能的微生物菌劑及發酵時間，研究其對堆肥溫度、惡臭物質含量和微生物菌群的影響，為大規模堆肥生產提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬糞取自輝縣市某養豬場，輔料玉米秸稈取自養豬場周圍農場，機械粉碎至2～3 cm的小段。有除臭功能的復合微生物菌劑由河南農業大學飼料生物技術實驗室制備，當各種菌濃度皆以1×109CFU/mL計算時，貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母和干酪乳桿菌在糞便發酵中的添加量分別為：0.05%、0.005%、0.001%和0.1%。堆肥原料的主要理化性質見表1。

表1 堆肥原料的主要理化性質(風干基礎)

1.2 主要試劑配制

1.2.1 納氏試劑

稱取12 g氫氧化鈉溶于60 mL水中，冷卻待用；稱取1.7 g二氯化汞溶于30 mL水中待用；稱取3.5 g碘化鉀于100 mL水中，在攪拌下緩慢加入二氯化汞溶液，直至形成紅色沉淀不再溶解為止；把氫氧化鈉溶液加入到二氯化汞和碘化鉀的混合溶液中，再加入剩余的二氯化汞溶液，混合均勻后，放于暗處靜置24 h，取上清液于棕色試劑瓶中，2～5 ℃保存。

1.2.2 鉻酸鋇懸浮液

稱取19.44 g鉻酸鉀和24.44 g氯化鋇，分別溶于1 L的去離子水中，在電爐上加熱至沸騰。將兩溶液混勻倒入一個3 L大燒杯中，待生成鉻酸鋇沉淀后倒出上清液，用去離子水洗滌5次沉淀，最后用去離子水定容至1 L，每次使用前需要搖動混勻。

1.3 堆肥試驗設計

試驗設5個處理組，每個處理3個重復，試驗分組見表2。把收集的新鮮豬糞便稱取80 kg于堆肥場空地上，用輔料玉米秸稈調節堆體含水率后，接入制備的復合微生物菌劑，混合均勻后用塑料薄膜密封發酵。試驗期為28 d，第1周每2 d人工翻堆1次，后續每5 d人工翻堆1次，每個處理組在堆肥環節上保持一致。

表2 堆肥試驗設計分組

1.4 樣品采集

在各堆肥體堆肥結束時，翻堆混合均勻后，在堆體四角和中心點各取200 g左右樣品，用四分法混合均勻后各取300 g左右裝入自封袋中，10 g左右樣品保存于4 ℃，用于測定微生物菌群和pH值指標，250 g左右樣品保存于-20 ℃，用于測定全氮、銨態氮、硫酸鹽、吲哚和水分指標。

1.5 指標測定

1.5.1 樣品銨態氮的測定

參照HJ/T 535—2009《水質 氨氮的測定 納氏試劑分光光度法》測定銨態氮。

標準曲線的建立：以硫酸銨為標準品繪制標準曲線，得到銨態氮濃度(μg/mL)與波長在420 nm下的吸光度值，建立回歸方程Y=6.991 4X-0.038 8，R2=0.990 7。式中X為波長420 nm下的吸光度值，Y為銨態氮濃度(μg/mL)。

樣品銨態氮測定：稱取5 g樣品加入25 mL 1 moL/L的NaOH溶液，180 r/min搖床振蕩30 min，移至50 mL離心管中，3 000 r/min離心5 min，上清液即為樣品測定液，吸取適當體積的樣品測定液，測定吸光度值。

銨態氮計算：銨態氮(mg/g)=(A×B×N/1 000)/M，其中A為樣品測定液由標準曲線求得銨態氮濃度(μg/mL)，B為反應液總體積(mL)，N為分取倍數，M為樣品質量(g)。

1.5.2 樣品硫酸鹽的測定

參照HJ/T 342—2007《水質 硫酸鹽的測定 鉻酸鋇分光光度法(試行)》測定硫酸鹽。

標準曲線的制作：以無水硫酸鈉為標準品繪制標準曲線，得到硫酸鹽濃度與波長在420 nm下的吸光度值的回歸方程Y=0.152 4X-0.000 7，R2=0.995 3。式中X為波長420 nm下的吸光度值，Y為硫酸鹽濃度(mg/mL)。

樣品硫酸鹽測定：取5 g樣品于150 mL三角瓶中，加20 mL去離子水，180 r/min搖床振蕩4 h，靜置2 h，加1滴10%醋酸鋅溶液，用NaOH溶液調節pH值至9.0，轉移至50 mL離心管中3 000 r/min離心5 min，上清即為測定液，吸取適當體積的測定液測定吸光度值。

硫酸鹽計算：硫酸鹽(mg/g)=(A×B×N)/M，其中A為樣品測定液由標準曲線求得硫酸鹽濃度(mg/mL)，B為反應液總體積(mL)，N為分取倍數，M為樣品質量(g)。

1.5.3 樣品吲哚的測定

參照文獻[14]的方法。

標準曲線的建立：以吲哚為標準品繪制標準曲線，得出吲哚濃度(μg/mL)與波長在525 nm下的吸光度值的回歸方程Y=0.001 7X+0.001 3，R2=0.992 4。式中Y為波長525 nm下的吸光度值，X為吲哚濃度(μg/mL)。

樣品預處理：稱取糞樣5 g，加入0.1 mol/L NaOH 20 mL，振蕩30 min，在100 ℃水浴條件下處理15 min，加入12.5 mL 0.1 mol/L NaOH，混合液轉移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，靜置30 min，上清液即為提取液。

樣品吲哚的測定：取25 mL比色管，依次加入2 g/L二苯胺磺酸鈉3 mL，1 mol/L HCl 6 mL。搖勻后加入10 g/L NaNO22.5 mL，待溶液紫色褪去后，4 ℃放置5 min。加入20 g/L氨基磺酸銨3 mL，待氣泡逸出后，加入2 mL提取液，用蒸餾水定容至刻度線。于55 ℃條件下顯色5 min，室溫放置15 min，525 nm處測定吸光度值。糞便吲哚含量=(A×V1)/(W×V2)，其中A為標準曲線求得的吲哚濃度(μg/mL)，V1為提取液體積(mL)，W為樣品質量(g)，V2為反應液體積(mL)。

1.5.4 其他指標的測定

溫度的測定：堆肥期間每天12:30用數顯式溫度計分別測定每個堆體上、中和下層溫度，取3個點的平均值，同時監測環境溫度。

含水率的測定：采用105 ℃恒溫干燥法。

全碳、全氮和pH的測定：按照NY525—2012《有機肥料》標準方法。

大腸桿菌和乳酸菌的測定：用稀釋平板涂布法，大腸桿菌涂布于伊紅美藍培養基上(蛋白胨10 g、乳糖10 g、磷酸氫二鉀2 g、瓊脂15 g、伊紅0.4 g、美藍0.065 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.0～7.3)，乳酸菌涂布于乳酸菌培養基上(蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂 0.58 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH值6.2～6.6)。37 ℃培養48 h，計算菌落數(CFU)，用自然對數(lg)表示。

1.6 數據統計與分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2003軟件進行初步處理后，用SPSS 20.0軟件進行ANOVA方差統計分析，結果用“平均值±標準差”表示，差異的顯著性用P<0.05表示。

2 結果與分析

2.1 微生物菌劑對堆肥溫度的影響

由圖1可知，在整個堆肥期，A、B、C、D和E組堆肥最高溫度分別為60、59.83、59.67、18.6和16.1 ℃，其中A、B和C組的堆體溫度顯著高于D組和E組(P<0.05)。A組50 ℃以上的堆肥溫度下共保持4 d，B和C組共保持5 d。在堆肥8～12 d和20～21 d，B組發酵溫度都高于A、C、D和E組(P<0.05)。堆肥結果顯示，B組的堆肥發酵效果相對較好。

圖1 堆肥過程中溫度的變化(n=3)

2.2 微生物菌劑對堆肥微生物菌群的影響

由表3可知，堆肥中E組大腸桿菌數量最多，B組大腸桿菌數量最少，B組大腸桿菌數量分別比D和E組減少了60.26%和62.84%(P<0.05)。B組乳酸菌數量比E組提高了14.41%(P<0.05)。

表3 微生物除臭劑對堆肥微生物菌群的影響(n=3) lg(CFU/g)

2.3 微生物菌劑對堆肥有關惡臭物質的影響

由表4可知，A組和B組之間堆肥銨態氮的濃度差異不顯著(P>0.05)，但A、B組均顯著低于其他組(P<0.05)。B組堆肥銨態氮/全氮值最低，與A、C、D和E組相比，分別降低了19.60%(P>0.05)、31.99%(P<0.05)、42.81%(P<0.05)和58.37%(P<0.05)。B組堆肥吲哚濃度最低，與A、C、D和E組相比，分別降低了16.08%(P>0.05)、8.43%(P>0.05)、53.36%(P<0.05)和67.52%(P<0.05)。D組堆肥硫酸鹽濃度最高，與A、B和C組相比，分別提高了49.89%(P<0.05)、31.07%(P<0.05)和40.42%(P<0.05)。堆肥結果顯示，B組能最大程度地減少堆肥惡臭氣體排放，提高堆肥養分質量。

表4 微生物除臭劑對堆肥惡臭組分的影響(風干基礎，n=3)

3 討論

3.1 微生物除臭菌劑對堆肥溫度的影響

堆肥發酵是堆肥原料中的有機物在微生物作用下，快速分解釋放大量的發酵熱，使堆體溫度逐步升高的過程，堆肥溫度一直是評價堆肥進程的重要物理指標[15]。堆肥過程的溫度一般需要經過升溫、高溫和降溫3個階段，其中高溫階段是堆肥最為關鍵的階段[15]。堆體溫度需保持在55 ℃達到3 d以上，或50 ℃達到5～7 d，是抑制堆體中病原微生物生長繁殖的重要條件[16]。通過在堆肥中添加功能性微生物菌劑可相對延長堆肥高溫階段持續時間，加快堆肥進程。李天樞[17]通過在由豬糞、牛糞和玉米秸稈組成的堆肥體中添加微生物菌劑，可使堆體在55 ℃以上維持5 d。王信等[18]在牛糞堆肥中添加微生物菌劑，僅用2 d時間溫度就上升到了50 ℃，且能維持高溫階段9 d，12 d便可完成發酵。本研究在堆肥中加入由貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母和干酪乳桿菌復配而成的微生物菌劑，用以提高堆肥發酵熱值，加快糞便發酵腐熟，取得了與前人一致結果。堆體水分含量是影響微生物生長代謝的重要因素，堆肥初始含水率在40%～70%才能保證堆肥的順利進行[19]。本試驗在控制堆肥含水率為40%～60%時，加入研制的復合微生物菌劑都可使堆肥在第4天達到最高溫度，可能是因為加入的菌劑中厚壁菌門的芽孢桿菌耐熱性有關，也有可能是加入的干酪乳酸桿菌對有機質的加速分解作用，不過溫度的變化受外界因素的影響也較大。

3.2 微生物除臭菌劑對堆肥微生物菌群的影響

糞便大腸桿菌數量常被用來作為評價糞便無害化處理的重要指標。潘攀[20]把微生物菌劑加入堆肥體，在堆肥開始時，測得的大腸桿菌數量大約為3 ×103CFU/g，控制堆體的初始溫度在45 ℃條件下，5 d后堆體中大腸桿菌的數量已經降到零，控制堆體初始溫度在25 ℃和35 ℃條件下，堆肥進行8 d后堆料中己檢測不出大腸桿菌。Turner[21]對堆肥中標記的大腸桿菌滅活所需的溫度進行了研究，結果表明，超過55 ℃約2 h才能使大腸桿菌滅活。本試驗發現，在堆肥結束時都能檢測到大腸桿菌的存在，但在加入秸稈調節堆體初始水分含量為50%左右的B組大腸桿菌數量顯著低于其他組。造成這種結果的原因可能是堆體維持的高溫期時間較短，不能完全使堆體中的大腸桿菌滅活，由于B組高溫持續時間長于其他組，使得檢測到的大腸桿菌數量顯著低于其他組，也說明了溫度對大腸桿菌滅活的影響。

3.3 微生物除臭菌劑對堆肥惡臭組分的影響

畜禽糞便中含有大量的未被消化吸收的蛋白質，其在一系列微生物的作用下產生大量的含氮臭氣，糞便堆肥過程中，有機氮的礦化、NH3的持續性揮發以及硝態氮的反硝作用是導致大量氮損失的重要原因，堆體銨態氮/全氮值的高低可以間接反應含氮化合物相互轉化的關系，銨態氮/全氮比值越低，堆體沉積的氮就越多[22]。堆肥過程中氮的形態包括總氮、有機氮、銨態氮和硝態氮，氮的轉化途徑主要有氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固定作用，大部分的揮發性氮素是在氮轉化細菌對含氮有機物降解過程中產生的，主要有氨化細菌、硝化細菌、反硝化細菌和自生固氮細菌[13]。在堆肥中加入微生物菌劑成為減少肥料氮損失的重要方法，張生偉[23]將微生物除臭劑加入豬糞和雞糞堆肥中，發現微生物除臭劑不僅有良好的除臭效果，而且減少了豬糞和雞糞堆肥中25.84%和28.65%的氮元素損失。本研究發現，在豬糞堆肥中加入微生物菌劑，可相對減少總氮、銨態氮濃度、銨態氮/全氮比值，說明菌劑中優勢微生物直接參與氮的轉化，或通過與氮轉化細菌的交互作用影響氮的代謝。

H2S和硫醇是含硫有害氣體的主要成分，糞便中有機含硫化合物通過硫轉化細菌的作用釋放出含硫氣體，H2S由于化學性質不穩定，可被硫氧化細菌氧化為硫酸鹽，糞便中的硫酸鹽和硫酸根在厭氧條件下通過硫酸鹽還原細菌的活動是產生硫化氫的主要途徑[24]。將微生物除臭劑加入豬糞和雞糞堆肥，在堆肥結束時與自然堆肥相比，加入微生物除臭劑的堆肥硫酸鹽含量顯著高于自然堆肥，并減少了含硫氣體的排放[23]。糞便中的蛋白質在一些腐敗微生物的作用下被分解產生L-色氨酸，進一步分解產生吲哚，吲哚與糞便臭味的產生有密切關系[24]。本試驗發現，在堆肥硫酸鹽上，B組堆體硫酸鹽含量高于A組和C組，說明B組在降低H2S排放方面要優于A組和C組；在吲哚的形成上，B組也顯著低于A組和C組。造成上述結果的原因可能是由于B組堆體水分含量適中，有利于優勢微生物的生長代謝，一方面優勢微生物可以利用一部分惡臭物質，另一方面優勢微生物可以抑制惡臭物質轉化細菌的代謝活動，進而抑制有機質向惡臭物質轉化，為畜禽糞污的無害化處理和資源化利用奠定了基礎。