補腎益智方可改善SAMP8小鼠記憶認知能力＊

張彩霞 張玉欣 接琳琳

（1.山東中醫藥高等專科學校，山東 煙臺 204199；2.莒縣中醫醫院，山東 日照 276500）

大量研究表明，60歲以后隨著年齡的增長人的認知記憶能力逐漸衰退，主要表現為老年人進行性記憶功能、認知功能和行為功能等障礙，這都是老齡化的表現。而認知記憶能力衰退又進一步影響到老年人生活質量與活動能力[1]。目前，改善老年人認知能力衰退多用中藥方劑調理，如補腎益智方、健腦益智湯、補陽還五湯等，通過保護海馬神經元，而達到緩解的作用[2]。臨床研究表明，補腎益智方可通過改善小膠質細胞介導的慢性炎癥反應，從而改善阿爾茨海默病模型小鼠的學習記憶能力[5]，進而緩解老年遺忘型輕度認知功能障礙[3]。因此，本研究探討應用補腎益智方對治療老年型記憶衰退的作用，為防治老年人記憶衰退開辟一條新途徑。

一、材料與方法

1.動物與分組

快速老化模型SAMP8小鼠 24只，3月齡，雄性，體質量為20～25 g。購自北京華阜康生物科技有限公司，動物許可證號 SCXK（京）2019-0008。飼養于山東中醫藥高等專科學校動物實驗中心 SPF級動物實驗室，動物實驗室內小鼠可自由飲水，通風良好，自然光照，室溫 （22±2）℃，明暗交替。適應性喂養2周。

將 SAMP8小鼠隨機分為 3組，分別為模型組、補腎益智方中藥低劑量組和補腎益智方中藥高劑量組。模型組小鼠按體重給予生理鹽水灌胃，低劑量中藥組給予補腎益智方藥液2.68 g/（kg·d）進行灌胃，高劑量中藥組給予補腎益智方藥液5.36 g/（kg·d）進行灌胃，連續灌胃6周。

2.儀器與試劑

Morris水迷宮測試軟件和設備購于廣州飛迪生物科技有限公司。蘇木精-伊紅（haematoxylin-eosin，HE）染色液購于碧云天生物技術有限公司。

3.方法

3.1 補腎益智方的制備 補腎益智方組成：熟地黃15 g、枸杞子20 g、山茱萸12g、鹽益智仁6g、丹參15 g、當歸10g、生白術10g、郁金10g、石菖蒲10 g、川芎10 g、人參12 g、遠志6 g，以上藥物經山東天江藥業制成免煎顆粒。補腎益智方劑量設定是根據成人的臨床給藥劑量 1.34 g/kg·d的2 倍、4倍確立，低劑量補腎益智方藥液終濃度為2.68 g/（kg·d）進行灌胃，高劑量補腎益智方藥液終濃度為5.36 g/（kg·d）。藥液配制完成后放置于 4℃冰箱冷藏備用，用前37℃溫水浴后搖勻。

3.2 Morris 水迷宮測試試驗 灌胃 42 d 后SAMP8小鼠可進行水迷宮適應訓練。首先訓練小鼠站臺，將SAMP8小鼠置于平臺上 1 min后，進行入水訓練，小鼠由不同象限入水，1 min/次。每只SAMP8小鼠參與訓練 2 次。若小鼠在規定時間內找不到站臺，人為引導到站臺，且停滯1 min。小鼠定位航行實驗共進行 5 d，將平臺轉移至第三象限中心，分別于上、下午各進行試驗1 次，試驗時間為1 min/次。調整第一象限的池壁中點作為入新的水點，上午和下午均以相同順序入水進行。若小鼠在60s內未能找到平臺，人為將小鼠引導至平臺，且在平臺停滯 1 min，再將小鼠放回籠內。以小鼠入水后的逃避潛伏期設為觀測指標，若小鼠在1min 內不能找到平臺，記錄為60s。定位航行試驗結束后，次日上午撤除平臺，進行小鼠空間探索試驗。在第一象限入水，記錄游泳軌跡，測量小鼠逃避潛伏期數據收集并進行比較分析。

3.3 動物取材及 HE染色 SAMP8小鼠 Morris 水迷宮試驗完成后，模型組、補腎益智方高劑量組和補腎益智方低劑量組小鼠，烏拉坦麻醉后，4%多聚甲醛灌流固定，剝離小鼠大腦，將大腦置于預冷的4%多聚甲醛溶液，4℃固定過夜，脫水、透明、全腦修塊、浸蠟、包埋，常規制作石蠟切片，進行HE染色，攝片。

4.數據處理

應用SPSS 22.0 統計分析軟件，按獨立樣本 t 檢驗進行顯著性檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1.補腎益智方對 SAMP8模型小鼠 Morris 水迷宮逃避潛伏期的影響

在Morris 水迷宮定位航行試驗中，隨著訓練次數的增加SAMP8模型小鼠的逃避潛伏期均呈下降趨勢（表1）。與模型組相比，補腎益智方組逃避潛伏期均明顯縮短。而高劑量組逃避潛伏期比低劑量組逃避潛伏期明顯縮短。

表1 各組小鼠定位航行實驗潛伏期用時比較（±s）

表1 各組小鼠定位航行實驗潛伏期用時比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05。

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2.補腎益智方對SAMP8模型小鼠腦組織病理形態的影響

模型組小鼠的海馬神經元排列紊亂、疏松，細胞結構不清晰。神經元數目減少，體積縮小，細胞核固縮呈不規則形。與模型組相比，補腎益智方組神經元排列緊密、整齊，輪廓相對清晰，未見核固縮等病理損傷。

三、討論

我國是世界上老年人口最多的國家，而且也是人口老齡化發展速度最快的國家之一[5]。隨著人口老齡化問題的日益加重，人們越來越多的關注于如何延緩衰老過程中記憶認知功能下降，促進記憶認知能力的發展，維持終生的腦健康。人類的老齡化過程會伴隨大腦的結構和功能變化，從而導致老年人的反應遲緩、工作和情節記憶以及執行能力等記憶認知能力下降，而老年人的記憶認知損害又進一步影響到老年人日常生活質量與活動能力。目前，改善老年人記憶衰退多用中藥方劑調理，如補腎益智方、健腦益智湯、補陽還五湯等，通過保護海馬神經元，而達到緩解的作用。

補腎益智方是針對阿爾茨海默病腎精不足、氣血虧虛的病理而設計的組方，具有補腎填精、益髓健腦、益氣養血活血的功效[6]。研究表明補腎益智方能夠降低阿爾茨海默癥大鼠腦內谷氨酸（Gu）和天冬氨酸（Asp）的含量，導致抑制性γ氨基丁酸（Y-GABA）和氨基酸甘氨酸（Gly）的含量升高，從而有預防及緩解阿爾茨海默病癥狀的功效[7]。實驗室水迷宮試驗也表明，補腎益智方能夠顯著提高大鼠學習記憶能力[8]。本研究利用快速老齡化SAMP8小鼠為模型，補腎益智方連續灌胃6周后，在 Morris 水迷宮試驗中發現模型組SAMP8小鼠有學習記憶功能受損的現象，而補腎益智方組小鼠的空間記憶學習功能有提高現象。表明補腎益智方能顯著提高SAMP8小鼠學習記憶能力，且補腎益智方高劑量效果優于低劑量。通過HE染色觀察，發現補腎益智方組能夠減輕SAMP8小鼠腦組織病理變化，有良好的保護神經元的作用。這可能與抗細胞凋亡機制有關。

綜上所述，本研究提示補腎益智方能改善老齡化引起的空間學習記憶認知障礙，表現為SAMP8模型小鼠行為學能力的提高及腦病理學變化，這可能與補腎益智方能夠調控神經元凋亡機制密切相關。但是中藥方劑具有靶點多、途徑多的特點，中藥方劑對神經元藥物的相關機制還有不明確，有待于進一步深入研究。