花生粕中黃曲霉毒素B1測定的方法改進與不確定度評定

杜宇峰，汪 浩，劉冠男

（青島市產品質量監督檢驗研究院，山東 青島 266101）

花生在我國廣泛種植，屬于我國六大油料作物中的一種[1]。花生經壓榨等方式制油后產生的副產品叫做花生粕。花生粕中的蛋白質含量較高且氨基酸種類豐富，被廣泛用于飼料中[2]。但是，花生粕在貯存過程中極易發生霉變而產生黃曲霉毒素，主要是黃曲霉毒素B1[3]。黃曲霉毒素B1具有較強的毒性和危害性，有致癌的危險，而且可以導致動植物細胞染色體的畸變[3]。所以，對于花生粕中黃曲霉毒素B1含量的測定和控制具有重要意義。本研究按照GB/T 36858—2018《飼料中黃曲霉毒素B1的測定 高效液相色譜法》對花生粕中黃曲霉毒素B1進行測定，同時進行了不確定度分析，全面地考慮了測定過程中的多個影響因素，并對其進行分析與合成，發現其中對測定結果影響最大的一項要素，提高了測定的準確度和數據的可靠性，以期對測定結果進行正確的評價與規范使用。

1 檢測試驗

1.1 儀器與設備

ML 204 T/02 型電子天平（量程為0～210 g，感量為0.000 1 g），梅特勒（上海）有限公司產品；1260 型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司產品；MP 21001型電子天平（量程為0～210 0 g，感量為0.01 g），上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；可調移液器（量程為1～10 mL），寶予德（中國）有限公司產品。

1.2 樣品與試劑

樣品：花生粕，從青島市李滄區農貿市場購買，經檢驗無霉菌污染。

試劑：黃曲霉毒素B1標準溶液（100.6 μg·mL-1，不確定度為1.4 μg·mL-1）；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），霍尼韋爾公司產品；三氯甲烷（色譜純），默克化工技術（上海）有限公司產品；三氟乙酸（TFA）（色譜純），阿拉丁試劑（上海）有限公司產品；冰乙酸（優級純），國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.3 檢測方法

依據標準GB/T 36858—2018《飼料中黃曲霉毒素B1的測定 高效液相色譜法》對花生粕中的黃曲霉毒素B1含量進行測定。但為了方便樣品的取用以及簡化檢測流程，在保證樣品均一性和穩定性的前提下，對樣品制備的方式進行了部分改進。

1.3.1 樣品處理

稱取花生粕樣品1 kg，高速粉碎后過2 mm 孔徑試驗篩，取孔徑2 mm 以下的粉末樣品，混合均勻作為待測試樣[4]。稱取待測試樣5.00 g于100 mL錐形瓶中，注入黃曲霉毒素B1提取液（乙腈∶水=84∶16）25.0 mL，以振蕩的方式提取黃曲霉毒素B1，提取條件為：轉速200 r·min-1，時長60 min。提取完畢將提取液經中速濾紙過濾，然后取10.0 mL 過濾完成后的提取液，用等體積的三氯甲烷進行萃取，進行1 min 的渦旋，混合均勻后靜置至清晰分層，將下層的萃取液放入15 mL具塞離心管中，在50 ℃水浴條件下通過氮氣吹干，加入200 μL 乙腈水溶液（乙腈∶水=90∶10），復溶后加入700 μL衍生溶液（三氟乙酸∶水∶冰乙酸=20∶70∶10，現用現配），混合均勻后衍生75 min，衍生條件為40 ℃水浴加熱，衍生完畢后用0.22 μm微孔濾膜過濾，制備待測試樣樣液。

1.3.2 標準溶液配制及處理

取100.6 μg·mL-1黃曲霉毒素B1標準溶液1.0 mL，用乙腈稀釋至10 mL，制得濃度為10.06 μg·mL-1的中間液，再用乙腈作為溶劑將此中間液稀釋100倍制得濃度為100.6 ng·mL-1的標準工作液。使用前再將此標準工作液配制成1、2、5、10、20、50、100 ng·mL-1的標準系列工作液。之后分別吸取0.9 mL的各個標準系列工作液至15 mL具塞離心管中，在50 ℃水浴條件下通過氮氣吹干，加入200 μL 乙腈水溶液（乙腈∶水=90∶10），復溶后加入700 μL衍生溶液（三氟乙酸∶水∶冰乙酸=20∶70∶10，現用現配），混合均勻后衍生75 min，衍生條件為40 ℃水浴加熱，衍生完畢后用0.22 μm微孔濾膜過濾，制備待測試樣樣液。

1.3.3 色譜條件

C18色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）的流動相為甲醇∶乙腈∶水=2∶1∶7，流速為1 mL·min-1，激發波長為365 nm，發射波長為440 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。

1.3.4 計算模型

按以下公式計算黃曲霉毒素B1含量w。

式中：w—樣品中黃曲霉毒素B1含量（μg·kg-1），ρ—樣品的衍生液在標準曲線上對應的黃曲霉毒素B1含量（ng·mL-1），V1—提取液總體積（mL），V2—用于萃取的提取液體積（mL），m—樣品質量（g）。

1.4 試驗方法的優化

按照GB/T 36858—2018《飼料中黃曲霉毒素B1的測定 高效液相色譜法》所采取的制樣方法，樣品的制備過程可簡述為：采集至少4 kg的樣品，進行縮分至2 kg 后再均勻分為4 份，取其中1 份進行粉碎和過篩后予以檢驗。此方式需要的樣品量較大，且需要進行多次分樣后進行樣品的粉碎過篩，試驗過程較為繁瑣，筆者參考GB 5009.22—2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B 族和G族的測定》[4]中所述的樣品制備方法，即稱取樣品1 kg，粉碎過篩混合均勻后作為待測樣品。本研究針對試驗用花生粕樣品采用兩種取樣方法進行檢測試驗，方法1：按照原標準的樣品制備方式，取4 kg 樣品，縮分至2 kg 后均勻分為4 份，將1 份樣品粉碎后過篩，將制備完畢的樣品平鋪，之后隨機對7個部位的樣品進行取樣，每個部位各取5.00 g，按1.3.1所述檢驗步驟進行試驗。方法2：稱取樣品1 kg，粉碎過篩混合均勻后作為待測樣品，將此待測樣品平鋪后，隨機抽取7 個部位的樣品各5.00 g，按照1.3.1所述的檢驗步驟進行檢驗。試驗結果見表1。

表1 兩種制樣方法的檢測試驗結果 ng·g-1

對于兩種制樣方法的試驗結果進行F檢驗，判斷兩種方法制備得到的樣品黃曲霉毒素B1含量是否存在差異。

式中：F—兩組數據的方差比值；S1—方法1中7次試驗數據的標準偏差；S2—方法2中7次試驗數據的標準偏差。

因為S2＞S1，則有以S22的作為分子進行比較。查F分布表，取顯著性水平α=0.01，自由度?1=7，?2=7時，Fs=6.993＞F。

說明兩組數據的精密度沒有顯著性差異，所以合并標準偏差為：

當自由度?=n1+n2-2=12，顯著性水平α=0.01時，查t分布表得到t0.01,12=2.681＞t。因參照的t、F分布表提供的數值均為單邊值，本試驗討論的制樣方法之間的差別屬于雙側檢驗的范疇，所以顯著性水平應為單側檢驗時的2 倍，此時可以得出結論：置信區域為98%的條件下，可以認為兩種制樣方法得到的樣品的黃曲霉毒素B1的含量沒有顯著性差異。

綜上得出結論：兩種取樣方法在98%的置信條件下無顯著性差異。在實際檢測中，可以考慮以方法2所述的制樣方法對標準既定的取樣方法予以優化，以期簡化流程、減少樣品采集的總量。

2 不確定度來源分析

對于該檢測試驗的不確定度來源進行分析，因為各個儀器使用溫度和環境溫度在試驗中基本保持恒定，所以由溫度導致的不確定度也可以忽略；又因為1 kg樣品全部用于制樣，且分別進行7次隨機取樣進行平行測定，所以由樣品均勻程度引入的不確定度可并入重復性測定的因素予以討論。此時，該試驗的不確定度來源主要有以下幾個方面：1）樣品稱量；2）標準溶液配制；3）樣液的稀釋和取用；4）重復性測定。

3 不確定度的分量評定

3.1 樣品稱量引入的不確定度

試驗中使用的是精度為0.000 1 g 的分析天平，從該天平檢定證書得到，此天平測量范圍在0～50 g時允許誤差最大為±0.000 5 g，不確定度按照B 類評定，按照矩形分布分析，取k= 3，從而得到因樣品稱量而產生的相對不確定度Urel(m)為：

3.2 標準溶液配制產生的不確定度

3.2.1 標準物質的不確定度

本試驗使用的標準物質（標準溶液儲備液）為黃曲霉毒素B1標準溶液（100.6 μg·mL-1，不確定度為1.4 μg·mL-1），在置信水平95%的條件下，按照B類評定得到，標準物質的不確定度為Urel(C1)：

3.2.2 因第1次稀釋導致的不確定度

第1次稀釋中使用的移液器的量程為1 mL，當吸取液體的體積為1 mL 時，依據JJG 646—2006《移液器檢定規程》及移液槍使用說明，此時移液器的允許誤差為10 μL，按照矩形分布取得到第1次稀釋過程中移液器使用導致的不確定度Urel(C2.1)為：

第1 次稀釋中使用的10 mL 容量瓶，依據JJG 196—2006《常用玻璃量器》中的檢定要求，體積容量誤差為±0.020 mL，得到第1 次稀釋過程中容量瓶使用導致的不確定度為Urel(C2.2)：

3.2.3 因第2次稀釋導致的不確定度

在第2 次稀釋過程中，使用的依然為3.2.2 中所述的1 mL 移液器，故得到第2 次稀釋中移液器使用導致的不確定度Urel(C3.1)為：

在此過程中，使用的容量瓶規格為100 mL，按照JJG 196—2006《常用玻璃量器》中規定的設備檢定要求，此規格容量瓶的體積容量誤差為±0.01 mL，可以得到第2次稀釋導致容量瓶的使用導致的不確定度Urel(C3.2)為：

合成以上不確定度分量，則得到本試驗使用的黃曲霉毒素B1標準工作液的相對不確定度為。

3.3 樣液稀釋和取用過程中引入的不確定度

提取液總體積為25 mL，提取液通過25 mL 大肚移液管（即A 級單標線吸量管）加入，依據GB/T 12808—2015《實驗室玻璃儀器 單標線吸量管》針對規格為25 mL 的A 級單標線吸量管的檢定要求，此移液管的容量允許誤差為0.030 mL，按照矩形分布取則得到由加入的提取液稀釋帶入的相對不確定度Urel(V1)為：

之后吸取提取液10 mL進行試驗，采用的移液設備為10 mL移液器，依據JJG 646—2006《移液器檢定規程》及該移液槍使用說明得到規格為10 mL的移液器，在取用液體體積為10 mL時的容量允許誤差為0.6%，從而得到取用樣液導致的相對不確定度Urel(V2)為：

合成以上不確定度得到在樣液稀釋和取用過程中的相對不確定度Urel(V)為：

3.4 重復性測定引入的不確定度

針對同一花生粕樣品進行7次平行試驗，得到的試驗結果見表2。

表2 重復性測定結果 ng·g-1

則含量平均值的相對標準不確定度為：

4 不確定度的合成

依據不確定度的合成公式，分別列出四項影響因素對于不確定度的貢獻及量值，結果見表3。

表3 花生粕中黃曲霉毒素B1含量測定的不確定度分量

從而得到，合成相對不確定度如下：

該試驗中，花生粕中黃曲霉毒素B1的含量為24.42 ng·g-1，其標準不確定度為：

在沒有特殊要求的情況下，擴展因子k的取值定為k=2，置信概率P=95%，對黃曲霉毒素B1檢測試驗結果所得到的標準不確定度進行擴展，得到擴展不確定度Uprel為：

Uprel=k×Urel(X)=0.67 ng·g-1

5 討 論

本試驗對于制樣方法的優化，針對試驗用的花生粕樣品進行7個平行驗證，驗證得到結論：針對此樣品，制樣方法可以通過步驟：稱取樣品1 kg，粉碎過篩，混合均勻后作為待測樣品予以簡化，對于其他類型的飼料基質還需要比對試驗予以驗證。

6 結 論

依據標準GB/T 36858—2018《飼料中黃曲霉毒素B1的測定 高效液相色譜法》[5]對于花生粕中黃曲霉毒素B1含量進行測定的過程中，共有以下四個方面的因素對測量不確定度的產生有所貢獻，分別為樣品稱量、樣液稀釋和取用、重復性測定以及標準溶液配制。由表3不確定度分量得到，通過該方法測定黃曲霉毒素B1含量，影響不確定度的最主要因素為標準溶液配制，樣品重復性測定以及樣液的稀釋與取用對此試驗的不確定度引入的貢獻適中，樣品稱量對于試驗結果的不確定度貢獻最小，最終試驗結果的不確定度可以表示為24.42±0.67 ng·g-1。