一株H3N2亞型豬流感病毒的分離鑒定

2021-04-13 09:21:54張智明李建華何世岷

飼料博覽 2021年3期

方超，張智明，李建華，何世岷

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

豬流行性感冒簡稱豬流感（Swine influenza，SI），是由A 型流感病毒引起的一種豬的急性呼吸道傳染病，主要臨床癥狀為咳嗽、打噴嚏、發(fā)熱、趴臥、食欲減退等[1-4]。豬流感的發(fā)病率極高，且傳染性強，很難切斷傳播途徑，一旦感染在短時間內(nèi)可波及全群，對豬的生長性能造成不良的影響。單純感染豬流感時死亡率并不高，但若與其他病原混合感染會使死亡率驟增，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-8]。豬流感病毒的流行存在地域性，易發(fā)生變異，且具有數(shù)十種亞型。豬流感的流行特點導(dǎo)致免疫接種是目前防控該病的唯一有效手段，因此從發(fā)病現(xiàn)地分離病毒并制備疫苗對該病的防控尤為重要[9-10]。

1 材料

疑似豬流感發(fā)病豬的鼻拭子樣品8份，某豬場現(xiàn)地采集；HI 效價為1∶640 的豬流感病毒H1 亞型特異性陽性血清，HI 效價為1∶640 的豬流感病毒H3 亞型特異性陽性血清，HI 效價為1∶320 的豬流感病毒H5 亞型特異性陽性血清，HI 效價為1∶320的豬流感病毒H9 亞型特異性陽性血清，豬流感病毒H1N1亞型HA和NA基因陽性質(zhì)粒，豬流感病毒H3N2 亞型HA 和NA基因陽性質(zhì)粒，均由哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；病毒基因組DNA/RNA 快速提取試劑盒，購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；DL-2000 DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；豬流感H1、H3、N1 和N2 的分型鑒定引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；1%雞紅細(xì)胞懸液，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司質(zhì)量管理部參照現(xiàn)行《中國獸藥典》制備保存；PBS 溶液，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心配制保存；SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司；4～6周齡健康易感的陰性仔豬10頭，購自哈爾濱市郊某豬場；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 病料的處理

取出采集到的鼻拭子樣品，充分振蕩后分別取出鼻拭子中的液體置于無菌離心管中，標(biāo)明序號，隨后將樣品經(jīng)8 000 r·min-1離心10 min，取上清液保存于-70 ℃冰箱中，備用。

2.2 病毒的分離

將處理好的上清液無菌接種于10～11 日齡SPF雞胚的尿囊腔，每個樣品接種5枚雞胚，每枚雞胚接種0.2 mL，接種后將雞胚的接種孔封蠟并置于35 ℃、濕度為60%～65%的孵化箱中培養(yǎng)，每隔12 h檢胚1次，24 h內(nèi)死亡的雞胚直接棄去，24 h后死亡的雞胚逐一收獲，培養(yǎng)72 h 取出全部雞胚置于2～8 ℃冷卻12 h以上，分別無菌收獲雞胚尿囊液并留樣進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗。檢出陽性樣品，置于-70 ℃冰柜保存?zhèn)溆茫? 代仍為陰性的樣品視為陰性，直接棄去（凝集價＜1∶16 判為陰性，凝集價≥1∶16判為陽性）。

2.3 半數(shù)雞胚感染量（EID50）的測定

用PBS 液將分離獲得的病毒液作10 倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-74 個稀釋度，分別經(jīng)尿囊腔接種10～11日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種5枚，每枚雞胚接種0.1 mL，置35 ℃、濕度為60%～65%的孵化箱中孵育觀察72 h，逐個收獲雞胚的尿囊液，分別測定紅細(xì)胞凝集價，凝集價≥1∶16者判為感染，使用Reed-Muench法計算EID50。

2.4 病毒的鑒定

2.4.1 血清學(xué)鑒定

取檢測為陽性的樣品按照現(xiàn)行《中國獸藥典》中方法配制4 HAU 抗原，分別與豬流感病毒H1、H3、H5、H9亞型特異性陽性血清中和，通過紅細(xì)胞凝集抑制試驗進(jìn)行血清學(xué)鑒定。

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

取陽性樣品，按劑盒說明書提取RNA。取10 μL RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μL：依次加入 Radom Primer 1 μL，模板 RNA 10 μL，72 ℃5 min后冰浴5 min，再加入5×反轉(zhuǎn)錄酶Buffer 4 μL、10 mmol·L-1dNTP 2 μL、RNA 酶抑制劑 0.5 μL、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、dd H2O 1.5 μL，然后置于96 ℃5 min，37 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h，用于PCR反應(yīng)。

用豬流感病毒H1、H3、N1、N2 亞型分型鑒定引物進(jìn)行PCR 鑒定，所擴(kuò)增片段大小依次為320 bp、750 bp、738 bp 和 498 bp[11]。PCR 擴(kuò)增體系為 25 μL：依次加入 10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，cDNA 1.0 μL，Taq酶0.5 μL，滅菌去離子水17.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，H1 型 53 ℃、H3 型 53.5 ℃、N1 型 52.5 ℃、N2 型 53 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃終止循環(huán)。將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳并與DL-2000 DNA Marker進(jìn)行比較，得出試驗結(jié)果。

2.5 病毒的純化與鑒定

按照2.3 中方法，用PBS 液稀釋分離到的病毒液，取 10-2、10-3、10-4、10-5、10-65 個稀釋度接種SPF 雞胚，每個稀釋度接種5 枚雞胚，每次僅收獲陽性樣品中最高稀釋度的單胚尿囊液用于傳代，連續(xù)純化3 代后的病毒液作為F0 代，進(jìn)行擴(kuò)繁F1代。純化后的病毒按照2.4.1、2.4.2 中的方法進(jìn)行血清學(xué)及分子生物學(xué)鑒定。

2.6 病毒的電鏡鑒定

將純化后的病毒樣品送至哈爾濱獸醫(yī)研究所電鏡室，進(jìn)行電鏡鑒定。

2.7 動物回歸試驗

從哈爾濱市郊購買4～6周齡健康易感的陰性仔豬10 頭，隨機(jī)選取5 頭，分別經(jīng)氣管接種病毒含量≥106.0EID50·0.1 mL-1的純化后的分離株病毒液4.0 mL，其余5頭相同條件下飼養(yǎng)作為對照。攻毒后1～5 d連續(xù)測溫，并觀察記錄豬流感特異性臨床癥狀；攻毒后1～3 d，每天分別采集每頭豬的鼻拭子并標(biāo)記好耳號，參照2.2中方法對30份鼻拭子樣品進(jìn)行病毒分離，每份樣品接種的雞胚中有1枚雞胚液紅細(xì)胞凝集價≥1∶16，即判為病毒分離陽性。分離陰性的樣品，應(yīng)盲傳1代，如仍為陰性，即判為病毒分離陰性；攻毒后5 d，對所有仔豬進(jìn)行大體剖檢，并觀察肺部病變。

3 結(jié)果與分析

3.1 病毒的分離

按照2.2 中方法操作，其中1 份病料接種的雞胚盲傳2 代時收獲的雞胚尿囊液出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集，效價為1∶128，通過有限稀釋法接種10～11 日齡雞胚檢測 EID50為10-5.32EID50·0.1 mL-1，結(jié)果見表1。病毒分離的胚體病理變化結(jié)果見圖1。由圖1 可見，接種后雞胚的胚體出現(xiàn)水腫、出血等病理變化。