宰后H2O2處理的藏羊肉能量代謝、細胞凋亡及嫩化研究

師希雄 岳建偉 張攀高 田 鑄 陳 騁 馬旭悅

(甘肅農業大學食品科學與工程學院，蘭州 730070)

0 引言

藏羊是我國特有的草地型藏系綿羊品種，主要分布在青藏高原及其鄰近區域。甘南藏羊包括歐拉、甘加與喬科3種類型，其中，歐拉藏羊以產肉為主，肉皮毛兼用[1]，其肉的蛋白質與能量含量高、脂肪與膽固醇含量低、礦物質與氨基酸含量相對較高以及風味物質豐富[2-3]。但是，藏羊肉嫩度較低，從而影響了食用品質。因此，有必要改善藏羊肉的品質。

宰后肉的成熟過程是肌細胞死亡與內部許多生化變化的過程，該過程可改善羊肉嫩度。在缺氧條件下，肌細胞死亡的方式以凋亡為主[4]。動物宰后肌細胞代謝過程會產生一系列活性氧簇(ROS)，主要包括過氧化氫、超氧自由基、羥自由基等[5]，其中大部分ROS由線粒體中電子傳遞鏈產生[6]。在正常生理狀態時，活性氧的產生與清除處于動態平衡，而宰后肌細胞在缺氧應激與營養物質缺少時，其抗氧化能力降低，部分ROS不能被清除，會破壞一系列正常的細胞信號通路，從而導致細胞凋亡，對肉的嫩度等品質產生影響[7]。因此，ROS會對宰后肌肉的能量代謝、細胞凋亡以及嫩化產生影響。

文獻[8]研究發現，骨骼肌積累過多的ROS可能會使線粒體結構發生破壞，最終誘導細胞凋亡。文獻[9]研究表明，通過H2O2誘導產生活性氧可改善鵝肉的嫩度。文獻[10]也證實，在U251細胞內由于H2O2誘導產生的ROS大量積累，導致線粒體通透性轉換孔增大，加劇了細胞色素C的釋放，促進了細胞凋亡。文獻[11]認為，ROS的堆積使得線粒體氧化應激水平提高，造成線粒體氧化損傷，從而發生凋亡，改善了牦牛肉的嫩度。但文獻[12]研究指出，ROS可抑制鈣激活酶的活力，不利于肉的嫩化。綜上所述，宰后H2O2處理對宰后肉嫩化的影響尚不明確，而且相關研究主要集中在豬肉、牛肉及禽肉的研究方面，關于ROS對青藏高原歐拉藏羊肉嫩化的影響尚未見報道，本文采用50 mmol/L和200 mmol/L的ROS激活劑(H2O2)分別處理歐拉藏羊背最長肌，在4℃條件下成熟，在成熟的不同時間點(0、0.5、1、3、5、7 d)分別測定ROS相對含量、ATP含量、Ca2+-ATPase和Na+/K+-ATPase活力、細胞凋亡率、肌原纖維小片化指數(MFI)與肌纖維直徑，研究H2O2對宰后藏羊肉能量代謝、細胞凋亡與嫩化的影響，以期為肉品質改善提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1試驗原料及樣品處理

隨機選取10只自然放牧、健康狀況良好的4～5歲歐拉型藏羊，屠宰后迅速取背最長肌(Longissimusdorsi，LD)分割成50 g左右的肉塊，再將肉塊隨機分為3組，分別用蒸餾水、50 mmol/L H2O2和200 mmol/L H2O2溶液處理，處理時按肉液比10 g/mL進行對稱注射。然后在4℃條件下進行成熟，在不同成熟時間點(0、0.5、1、3、5、7 d)分別取樣，用于ROS及肉品質的測定。

1.1.2試驗儀器與試劑

試驗儀器：AL104型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；HG101-A型電熱鼓風干燥箱，南京騰飛實驗儀器有限公司；PHS-3C型pH計，上海寧隆儀器有限公司；BCD-450WDS型冰箱，海爾集團；HG200-158型插入式pH計，北京百萬電子科技有限公司；CR-10型小型色差儀，日本KonicaMinolta公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計，島津上海有限公司；TGL-24MC型高速冷凍離心機，湖南平凡科技有限公司；RF 5301-PC型熒光分光光度計，日本島津公司。

試驗試劑：過氧化氫、戊二醛、檸檬酸鉛、甘露醇、蔗糖、無水乙醇、硫酸鋁鉀、甲醛、酒精、冰醋酸、甘油、碘酸鈉、二甲苯、蘇木清過氧化氫、多聚甲醛、醋酸雙氧鈾，均為分析純；ROS檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1ROS相對含量測定

ROS相對含量的測定參照文獻[13]的方法并稍作修改，取蛋白質量濃度為0.1 mg/mL蛋白懸浮液，然后按體積比1∶1的比例將蛋白懸浮液與10 μmol/L DCFH-DA工作液(用50 mmol/L、pH值7.4磷酸鹽緩沖液配置而成)充分混合。將混合后的液體立即在37℃的水浴鍋中孵育15 min，之后將混合液離心8 min(12 000g，4℃)，再用熒光分光光度計測定熒光強度，ROS相對含量用每毫克蛋白的相對熒光強度表示。

1.2.2ATP含量測定

操作步驟和計算公式參照文獻[11]的方法。

1.2.3Ca2+-ATPase和Na+/K+-ATPase活力測定

操作步驟和計算公式參照文獻[11]的方法。

1.2.4細胞凋亡率測定

參照文獻[14]的方法進行測定。利用原位末端法(TUNEL)原理，將羊肉切成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉塊，用4%多聚甲醛溶液進行固定，然后將羊肉組織先用石蠟包埋，再冰凍切片、脫蠟、封閉、漂洗，用熒光顯微鏡測定并計數。

1.2.5肌原纖維小片化指數(MFI)測定

參照文獻[15]的方法,并稍作修改。稱取剔除脂肪和筋膜的肉樣,加入肉樣20倍體積的MFI緩沖液(20 mmol/L K3PO4、100 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3、1 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸), pH值7.1)，10 000 r/min冰浴勻漿得到肌原纖維蛋白懸濁液，并在4℃、1 000g下離心15 min，棄上清液，將沉淀繼續懸浮于20倍體積的MFI緩沖液中，重復上述步驟1次。再將肌原纖維蛋白懸浮于10 mL MFI緩沖液，然后通過200目尼龍篩網過濾。雙縮脲法測蛋白質量濃度，并將蛋白質量濃度稀釋至0.5 mg/mL，540 nm處測定吸光度，吸光度乘以200即為MFI。

1.2.6肌纖維直徑測定

參照文獻[16]的方法，并稍作修改。將肉樣切割成尺寸(長×寬×高)為1.0 cm×0.3 cm×0.3 cm的肉塊，放入10%甲醛溶液浸泡48 h，制作石蠟切片，然后染色，中性樹膠封片后顯微拍照。然后用image-ProPlus 6.0軟件測量單根肌纖維直徑。

1.3 數據處理

采用SPSS 19.0軟件進行方差分析(ANOVA)，用Duncan法進行多重比較。所有指標測定3次，結果用平均數±標準差表示，用Microsoft Office Excel 2010軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 H2O2處理對藏羊肉成熟過程中ROS相對含量的影響

ROS作為一種信號分子，在細胞中產生與消除的動態平衡如果被打破，就會產生過量的ROS，從而導致氧化應激反應[17]。由圖1(圖中相同時間不同字母表示不同處理組之間差異顯著(P<0.05)，下同)可知，H2O2處理藏羊肉0.5 d后，處理組與對照組的ROS相對含量呈現先上升后下降的趨勢，第3天時達到最大值，之后，不斷下降。第7天時，50 mmol/L H2O2處理組的ROS相對含量比對照組高39.19%(P<0.05)，可能由于H2O2作為ROS的誘導劑，促進了ROS的生成。本試驗結果與文獻[18]研究發現過氧化氫處理使宰后牦牛肉成熟過程中線粒體ROS水平升高以及文獻[19]報道的過氧化氫處理后雞胚成肌細胞ROS水平上升相一致。由此可見，采用H2O2處理歐拉藏羊肉后，由于H2O2的誘導作用，使得羊肉中ROS相對含量增加，氧化應激水平提高。

2.2 H2O2處理對藏羊肉成熟過程中ATP含量的影響

ATP既是細胞的直接供能物質，也是維護細胞離子穩態的關鍵調節因子，主要來源于線粒體，線粒體的結構和功能直接影響肌肉的能量水平[20]。同時，ATP是caspases家族發生級聯反應的必要條件，細胞凋亡的發生與ATP含量的變化密切相關[21]。從圖2看出，處理組與對照組ATP含量隨著宰后時間的延長呈下降趨勢。處理后第7天時，50 mmol/L H2O2和200 mmol/L H2O2處理組ATP含量分別比對照組低25.73%和25.77%(P<0.05)。試驗結果表明，H2O2處理歐拉藏羊肉導致了成熟過程中ATP含量的顯著降低，可能由于H2O2誘導產生的ROS在線粒體中大量積累，造成線粒體結構和功能受損，抑制了ATP的產生[22]。文獻[23]研究發現，大鼠心肌細胞經 1 mmol/L H2O2處理后，ATP含量逐漸下降。文獻[24]研究表明，ROS的大量積累，導致電子傳遞鏈功能受損，ATP合成減少。此外，文獻[25]報道，H2O2誘導產生的氧化應激，導致ATP水平和線粒體膜電位下降。本研究結果與上述報道相一致。由此可知，采用H2O2處理后，宰后歐拉藏羊肉成熟過程中ATP含量顯著降低。

2.3 H2O2處理對藏羊肉成熟過程中能量代謝酶的影響

ATPase作為維持生物體正常生理代謝的重要酶系統，其中，Na+/K+-ATPase為維持胞外高鈉、胞內高鉀的不均衡離子分布，通常會將胞內的鈉離子轉運到胞外，同時將胞外的鉀離子轉移到胞內。Ca2+-ATPase通過主動轉運Ca2+，使胞漿內游離Ca2+處于較低水平，保證細胞的正常生理功能[26]。由圖3可知，隨著成熟時間的延長，處理組和對照組的Na+/K+-ATPase活力和Ca2+-ATPase活力均呈整體下降趨勢，且H2O2處理組Na+/K+-ATPase活力和Ca2+-ATPase活力均顯著低于對照組(P<0.05)，H2O2處理后第7天時，50 mmol/L H2O2和200 mmol/L H2O2處理組Ca2+-ATPase活力分別比對照組低38.39%和36.70%(P<0.05)，Na+/K+-ATPase活力分別比對照組低27.30%和29.46%(P<0.05)。結果表明，H2O2處理后，藏羊肉成熟過程中Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力顯著降低，可能由于處理后ROS相對含量增加，造成線粒體膜脂質的破壞，從而使Na+/K+-ATPase、Ca2+-ATPase活力下降[27]。文獻[28]報道，經H2O2處理2 h后的心肌細胞，Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase 活力顯著低于正常對照組。文獻[29]研究發現H2O2處理(姜黃素處理作對照)的H9c2心肌細胞，Na+/K+-ATPase活性顯著低于對照組。同時，文獻[30]研究表明，H2O2處理組線粒體Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力與對照組相比均顯著降低。本試驗結果與以上報道相似。由此可見，采用H2O2處理歐拉藏羊肉后，宰后成熟過程中由于ROS對線粒體膜的破壞，導致了Na+/K+-ATPase活力和Ca2+-ATPase活力顯著降低。

2.4 H2O2處理對藏羊肉成熟過程中細胞凋亡率的影響

細胞凋亡是細胞的程序性死亡，細胞凋亡率能夠客觀地反映細胞凋亡程度[31]。從圖4可以看出，采用TUNEL法對宰后藏羊肉成熟過程中骨骼肌細胞的凋亡率檢測發現，處理組與對照組的細胞凋亡率均隨著宰后成熟時間的延長呈上升趨勢。H2O2處理后，第3～7天時，H2O2處理組的細胞凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)，第7天時，50 mmol/L H2O2和200 mmol/L H2O2處理組細胞凋亡率分別比對照組高63.07%和50.42%(P<0.05)。可能因為H2O2處理后，ROS相對含量增加，造成線粒體的氧化損傷，線粒體膜電位下降，進而導致細胞凋亡，從而使凋亡率增加[32]。文獻[33]研究發現，外源過氧化氫可引起線粒體損傷，促進細胞凋亡的發生。此外，文獻[34]也研究表明，ROS可促進細胞凋亡的發生。本研究結果與以上報道相似。由此可見，采用H2O2處理歐拉藏羊肉后，由于ROS的增加，可能造成線粒體的氧化損傷，線粒體膜電位下降，進而導致細胞凋亡，凋亡率增加。

2.5 H2O2處理對藏羊肉成熟過程中MFI的影響

MFI表征肌原纖維內部結構破壞的情況，其大小可反映肉的嫩化程度，MFI越大，表明肌原纖維內部結構受破壞的程度越大，肉的嫩度也越好[35]。從圖5可以看出，處理組與對照組的MFI隨宰后時間的延長整體呈上升趨勢。H2O2處理藏羊肉0.5 d后，H2O2處理組的MFI均顯著高于對照組(P<0.05)。第7天時，50 mmol/L H2O2和200 mmol/L H2O2處理組MFI分別比對照組高5.74%和5.19%(P<0.05)。結果表明，H2O2處理后MFI顯著升高，可能由于處理后ROS增加，誘導了細胞凋亡，啟動了caspases 級聯反應，從而對肌原纖維蛋白進行降解，破壞了肌原纖維的內部結構，導致MFI升高[14]。文獻[36]研究發現，ROS 可促進鈣蛋白酶的激活，有利于肌原纖維蛋白的降解。此外，文獻[11]報道，牦牛肉宰后成熟過程中H2O2處理組 MFI顯著高于對照組。本研究結果與上述報道相似。因此，采用H2O2處理歐拉藏羊肉后，促進了ROS的生成，誘導了細胞凋亡，激活了細胞凋亡酶，對肌原纖維蛋白進行降解，導致MFI增加。

2.6 宰后H2O2處理對藏羊肉成熟過程中肌纖維直徑的影響

肌纖維直徑是評價肌纖維組織學特性的指標之一，其越細肉質越嫩，肉品質越好[37]。圖6反映了宰后H2O2處理對藏羊肉成熟過程中肌纖維直徑的影響，由圖6可知，隨著宰后成熟時間的增加，處理組與對照組的肌纖維直徑均呈現整體下降的趨勢。H2O2處理藏羊肉7d時，50 mmol/L H2O2和200 mmol/L H2O2兩個處理組肌纖維直徑分別比對照組低13.68%和13.94%(P<0.05)。結果表明，H2O2處理藏羊肉后，肌纖維直徑顯著降低，可能由于H2O2處理后，ROS增加，促進了細胞凋亡的發生，從而使肌原纖維蛋白結構發生變化，導致了肌纖維直徑減小，嫩度增加。該結果與文獻[38]報道的H2O2處理牦牛肉后嫩度提高的結果相似。總之，采用H2O2處理后，歐拉藏羊肉的肌纖維直徑顯著降低，促進了肉嫩度的改善。此外，過氧化氫處理后ROS生成增多，可能通過攻擊多不飽和脂肪酸，導致風味發生變化[39]；其次，造成凋亡的發生，可能破壞線粒體電子傳遞鏈，造成肉色的褐變[40]，同時，激活了細胞凋亡酶，可能對肌原纖維蛋白發生降解，引起質構的變化[41]。因此，H2O2對歐拉藏羊肉其他品質的影響有待進一步研究。

3 結束語

采用蒸餾水、50 mmol/L與200 mmol/L的過氧化氫對藏羊肉進行處理，測定了ROS相對含量、ATP含量、Ca2+-ATPase和Na+/K+-ATPase活力、細胞凋亡率、MFI與肌纖維直徑在成熟期間的變化。結果表明，成熟7 d時，50 mmol/L和200 mmol/L處理組與對照組相比，ATP含量分別降低了25.73%和25.77%，Ca2+-ATPase活力分別降低了38.39%和36.70%，Na+/K+-ATPase活力分別降低了27.30%和29.46%，肌纖維直徑分別降低了13.68%和13.94%(P<0.05)，細胞凋亡率分別提高了63.07%和50.42%，MFI分別提高了5.74%和5.19%(P<0.05)。因此，采用過氧化氫處理藏羊肉可促進肉的嫩化。本研究可為肉品質改善提供理論參考。