乳液中柔性界面蛋白構效關系研究

朱 穎 趙思明 王冬梅 江連洲 王中江 范志軍

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院，哈爾濱 150028; 2.東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030;3.黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司，佳木斯 154000)

0 引言

目前，水包油型乳液被廣泛應用于化妝品、護膚品、制藥和食品工業中。乳液是一種不穩定的液體，乳滴易發生絮凝和聚集甚至沉降等現象[1]。因此，一些表面活性劑被應用于降低界面張力并形成粘彈性保護層，從而抑制油滴的聚集[2]。蛋白質作為一種高效的食品乳化劑，具有親水親油性質。蛋白質的關鍵功能特性是通過吸附至油、水兩相之間的界面處形成并穩定乳液，從而降低界面張力、增強界面膜的穩定性[3]。已有研究證明了油水界面吸收的乳蛋白層在穩定乳液中的作用[4-5]。鷹嘴豆蛋白是具有最高彈性模量的乳化劑，可以形成較小尺寸液滴，同時提高乳液的抗氧化性[6]。蛋白質在溶解過程中發生結構的解折疊，蛋白質構象的改變使疏水性殘基暴露，從而改善了乳化性能[7-8]。文獻[9]研究了蛋白質濃度對蛋白質乳液性質的影響，結果表明，乳液的流變行為取決于蛋白質的種類和濃度。蛋白質分子的柔性差異取決于不同程度的結構變化[10]。文獻[11]從蛋白質的不同結構角度研究分子柔性與乳化性的關系。由于蛋白質對外界環境因素具有敏感性，故會因蛋白質結構的穩定性差異而影響蛋白質乳液的穩定性[12]。因此，對蛋白乳液穩定機理進行深入探究有利于拓寬其在工業生產中的應用范圍。

界面蛋白的吸附是一個動態過程，蛋白分子吸附到油滴表面，形成不均一的蛋白膜。因此，界面蛋白可以在乳液中同時與油相和水相結合，包裹油滴，防止液滴聚沉，從而起到穩定乳液的作用。研究表明，乳液中界面蛋白的含量越高，越有利于降低油水界面張力，乳液穩定性越強[13-14]。界面蛋白的結構性質是影響乳液穩定性的重要因素，一些學者對此進行了相關研究[15-21]。蛋白質的界面功能性表達歷經分子吸附、結構重排、界面擴張等復雜過程，從蛋白質的天然穩態結構難以分析界面功能性表達的構效關系，通過柔性結構分析、確定功能單位或結構域可為深入解析大豆蛋白界面功能性質提供可靠依據。

關于乳狀液穩定性和蛋白質表面活性的研究較少，迄今為止，尚未見關于乳狀液中界面蛋白柔性的相關報道。本文采用紅外光譜、紫外光譜、熒光光譜分析不同品種大豆蛋白乳液中界面蛋白的結構特征，探究界面蛋白的柔性結構，通過分析不同品種界面蛋白的表面疏水性、二硫鍵含量、溶解性和乳化性等，對比界面蛋白的功能性，以期解析界面蛋白的柔性結構對功能性質的影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，實驗室自提；葵花籽油，市售；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，北京新光化工試劑廠；正己烷、乙醇、甲醇，天津北科化學品有限責任公司；其他化學試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器公司；FD5-3型冷凍干燥機，美國SIM公司；PHSJ-4A型實驗室pH計，上海雷磁公司；電子分析天平(0.000 1 g)，北京賽多利斯儀器系統有限公司；ULTRA-TURRAX UTL2000型乳化機，德國IKA儀器設備公司；F-4500型熒光分光光度計，日本HITACHI公司。

1.3 界面蛋白提取

將大豆分離蛋白溶解在0.05 mol/L、pH值7.5±0.1的磷酸鹽緩沖溶液中配置成1%的蛋白溶液，室溫(20℃)下攪拌2 h，然后4℃靜置充分后水和12 h。加入0.02%的疊氮化鈉，防止微生物生長。按照葵花籽油與蛋白質質量比1～1.5加入葵花籽油，然后用FJ-200型高速均質器在20 000g下進行5 min均勻化，然后立即在50 MPa的壓力下進行高壓均勻化。制得的乳液用于以下研究。

界面蛋白的提取參照文獻[22]的方法并進行了修改，將上述不同品種大豆蛋白乳液首先進行10 000g離心10 min，去上層乳液層添加4倍體積去離子水進行水洗30 min，然后20 000g高速離心20 min，取下層溶液進行酸沉(pH值4.5)得到蛋白沉淀，然后將沉淀后的蛋白堿溶(pH值8.0)，凍干得到界面蛋白。

1.4 指標測定

1.4.1界面蛋白含量測定

參照文獻[23]的方法測定不同品種大豆蛋白乳液界面蛋白含量。將乳液樣品在室溫15 000g的條件下離心40 min，使樣品乳液分層。頂部是乳液油層，底部是蛋白水相。使用牛血清蛋白作為標準物，通過文獻[24]方法測定底部溶液和初始蛋白溶液的蛋白濃度，界面蛋白質量分數計算式為

(1)

式中CI——最初乳液中總的蛋白質量比，g/g

Cs——上清液中的蛋白質量比，g/g

1.4.2界面蛋白氨基酸組成測定

氨基酸組成測定參照文獻[25]的方法。使用Hitachi L-8800型自動氨基酸分析儀(德國曼默博爾公司)測定氨基酸組成。在110℃下將蛋白質樣品在密封管中用6 mol/L HCl水解24 h。水解后將溶液進行凍干處理，復溶過濾待用。在38℃下進行測定，檢測波長為254 nm，流速為1.0 mL/min。樣品氨基酸組成用氨基酸占蛋白質質量分數來表征。

1.4.3紅外光譜分析(FTIR)

界面蛋白的紅外光譜測定參照文獻[26]的方法。FTIR光譜在波長4 000～400 cm-1范圍內進行掃描，界面蛋白研磨成粉末，并在室溫下利用KBr進行壓片(每1 mg蛋白使用100 mg KBr)。每個光譜平均掃描60次，分辨率為2 cm-1。酰胺I帶的分析在1 700～1 600 cm-1的區域內進行。蛋白的二級結構由“peak fitting”軟件進行擬合獲得。

1.4.4十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)

SDS-PAGE根據文獻[27]方法進行實驗，配制12%的分離膠和5%的濃縮膠。將溶解好的大豆分離蛋白(6 mg/mL)與上樣緩沖液混合后沸水浴5 min，3 000g離心5 min后上樣到凝膠中。濃縮膠先以80 mV進行跑膠，然后在分離膠中以120 mV進行電泳，直到到達凝膠底部為止。電泳完成后，將凝膠用0.05%考馬斯亮藍(R-250)染色，染色時間為30 min，最后用脫色液(甲醇、冰乙酸、水，體積比1∶1∶8)洗脫至條帶清晰。使用Molecular Imager Gel Doc(美國加利福尼亞州Bio-Rad實驗室)分析凝膠條帶并進行拍攝。

1.4.5熒光光譜分析

采用F-4500型熒光分光光度計(日本HITACHI公司)對樣品進行熒光光譜測定。將不同品種的SPI(大豆分離蛋白)溶液稀釋，使其質量濃度達到0.2 mg/mL。光譜測定條件設置為：激發波長(Ex)280 nm，掃描波長(Em)為300～500 nm，激發狹縫寬度(Ex Slit)為5 nm，同樣發射狹縫寬度(Em Slit)也為5 nm。重復掃描3次。

1.4.6紫外掃描

將界面蛋白溶液稀釋到0.1～0.2 mg/mL進行紫外光譜掃描，波長范圍 250～350 nm，掃描速率100 nm/min，分辨率為 0.2 nm，重復掃描3次記錄平均值。

1.4.7表面疏水性分析

參照文獻[28]的方法，使用疏水性熒光探針8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)測定表面疏水性。在0.01 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(pH值7.0)中制備8×10-3mol/L ANS溶液和0.01 g/mL蛋白質溶液。取5 mL蛋白溶液加入50 μL 10 mmol/L的ANS溶液。將混合物渦旋振蕩約5 s。在(20±5)℃條件下，使用Tecan M200 PRO(美國普洛麥格公司)設置激發波長(Ex)為390 nm，掃描波長(Em)為468 nm，激發和發射狹縫寬度(Ex Slit和Em Slit)為5 nm，掃描速率(Scan spe)為10 nm/s。以熒光值為因變量，SPI質量濃度為自變量作圖，得到的一次函數擬合線的初始斜率為表面疏水性指數。

1.4.8二硫鍵含量測定

SPI中-SH和-SS含量參照文獻[29]的方法測定。在0.5 mL的樣品溶液中加入2.5 mL含有8 mol/L Urea(尿素)的Tris-甘氨酸緩沖液和0.02 mL含有1% DNTB(5,5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸)的Tris-甘氨酸緩沖液，將其置于40℃水浴中保溫25 min。利用雙光束分光光度計(日本HITACHI公司)在412 nm處測量其吸光度。Tris-甘氨酸緩沖液作為空白對照。-SH和-SS質量摩爾濃度計算公式為

(2)

式中A412——412 nm處的吸光度

C——樣品質量濃度，mg/mL

D——稀釋因子，-SH取5.02，-SS取10

1.4.9界面蛋白溶解性測定

應用BCA測定法測定蛋白質濃度。將含有Cu2+和BCA試劑的工作液添加到梯度標準溶液(每1 mL PBS緩沖溶液中有5 mg牛血清白蛋白)及200 μL蛋白樣品的96孔板中，并于37℃保溫30 min。采用Tecan M200 PRO型酶標儀記錄在562 nm處的吸光度，溶解度計算公式為

(3)

式中Cu——上清液蛋白質量濃度

Ct——總蛋白質量濃度

1.4.10界面蛋白乳化性質測定

根據文獻[30]的方法，測定乳化性指數(EAI)和乳化穩定性指數(ESI)。將葵花籽油和蛋白質溶液(0.2 mg/mL)以1∶3的體積比放入燒杯中，然后使用Ultra-Turrax T18型均質器將其均質化3 min。然后立即用0.1%SDS將50 μL乳液稀釋100倍。使用分光光度計(上海SHJH有限公司)記錄500 nm處和10 min后的吸光度。EAI和ESI計算公式為

(4)

(5)

式中EAI——乳化性指數，m2/g

ESI——乳化穩定性指數，min

L——比色皿的光路長度，取1 cm

θ——乳液的油相分數，取25%

A0、A10——乳液在0、10 min的吸光度

1.5 數據統計及分析

所有的實驗至少進行3次，利用SPSS Statistics軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析。采用Origin 9.1軟件、PeakFit 4.12分析軟件對數據進行處理。

2 結果與討論

2.1 界面蛋白含量

前期研究[31]確定12種蛋白的柔性從大到小依次為HH-53、HN-87、HN-48、HN-44、HN-61、HN-52、HH-49、JY-55、HN-85、HN-66、HN-69、HH-51(HH代表黑河品種大豆，HN代表黑農品種大豆，JY代表金源品種大豆)。柔性較高的蛋白以較快的吸附速率吸附到水油界面處，增加乳液中界面柔性蛋白的含量。圖1(圖中不同字母表示差異顯著，下同)顯示了不同品種蛋白乳液的界面柔性蛋白質量分數，HH-53、HN-87、HN-48和HH-44蛋白制備的乳液含有超過50%的界面柔性蛋白，而HN-66、JY-55、HN-85和HN-61蛋白乳液含有40%～50%的界面蛋白，HN-52、HH-49和HH-51蛋白乳液中界面蛋白質量分數在40%左右。這說明仍有很多未吸附的蛋白分子存在于水溶液中。柔性蛋白會增加油滴表面的吸附蛋白含量，有利于界面分子間的相互作用，從而提高乳液的穩定性。文獻[32]研究表明，界面蛋白含量越高，乳液越穩定。

2.2 界面蛋白氨基酸組成

已知大豆蛋白包含人體所需的8種必需氨基酸，界面蛋白和大豆分離蛋白的氨基酸組成差異不大。通過表1比較可知，HN-48和HN-87界面蛋白含有較多的疏水性Leu和Phe，這可能與HN-48和HN-87蛋白構成的乳液的穩定性有相關性。蛋白柔性較高，會導致含更多疏水性氨基酸的蛋白吸附在水油界面，形成穩定的界面膜。而HN-69、HN-52和HN-61含有更多的酸性氨基酸Glu和Asp，導致分子間斥力增加，這可能是導致其界面蛋白柔性較低的原因。HN-61、HN-66、HN-69和HN-85界面蛋白的堿性氨基酸Lys顯著低于其他品種界面蛋白，這與本團隊之前研究[31]的氨基酸分離組成對柔性蛋白的影響保持一致。柔性蛋白具有的氨基酸組成特點決定了柔性蛋白質的結構[33]。文獻[34]研究證實疏水性和帶電性氨基酸的分布將影響蛋白質分子的柔性，進而影響蛋白質的功能性質。文獻[35]的實驗結論進一步證明了課題組的實驗結果，在相鄰多肽鏈分布的疏水性和帶電荷氨基酸殘基趨向于重排并暴露在蛋白質分子的表面。

表1 不同品種界面蛋白的氨基酸質量分數Tab.1 Content of different amino acids in different interface proteins %

2.3 界面蛋白二級結構

傅里葉紅外光譜(FTIR)是一種用來分析蛋白質結構特征的光譜方法[36]。不同品種界面蛋白的紅外光譜圖見圖2，采用Gauss面積法擬合對界面蛋白的酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)紅外譜圖進行二階求導，可計算得出界面蛋白的二級結構相對含量，如表2所示。不同品種的界面蛋白均以β-折疊結構為主，其中柔性較高的HN-87、HN-48、HH-44和HH-53界面蛋白含有較多的無規則卷曲結構和較低含量的α-螺旋結構。這4種界面蛋白所含有的柔性結構較多，更有利于在界面處展開，穩定乳液。文獻[37]研究證明，α-螺旋位于多肽鏈骨架的內部，與蛋白質的穩定性相關，而無規則卷曲結構更多地與蛋白質的柔性相關。因此，界面蛋白內部骨架穩定性降低，其柔性結構增加，更有利于吸附到水油界面處。

表2 不同品種界面蛋白的二級結構相對含量Tab.2 Secondary structure content of different interface proteins by FTIR %

2.4 界面蛋白亞基組成

不同品種界面蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳分析見圖3(圖中M表示標準品Marker)。大豆分離蛋白由7S和11S蛋白組成，共多個不同分子質量的亞基。而界面蛋白的結構組成中差異較大，部分條帶顏色深且寬，部分條帶較淺，這是由于在穩定乳液后的蛋白中部分蛋白無法進入電泳槽。其中HN-69、HH-49和HN-52界面蛋白條帶顏色最淺，這3種蛋白的柔性較差，因此吸附在界面處的含量較少導致在提取過程中含量低。也有可能是因為界面蛋白在提取過程中存在少許的交叉污染[38]。經離心后的JY-55、HH-51、HN-66、HN-85、HN-61界面蛋白組成中11S蛋白含量較高，而HH-53、HN-48、HH-44、HN-87界面蛋白中7S蛋白比重增加。7S蛋白的結構柔性高于11S蛋白，二者的比重將影響界面蛋白的結構組成，進而影響其功能性質表達。

2.5 界面蛋白表面疏水性

目前研究學者認為，蛋白質吸附于水油界面后，蛋白質界面層的流變性質主要來自于疏水相互作用和二硫鍵的貢獻[39]。不同品種界面蛋白的表面疏水性如圖4所示，反映了界面蛋白的結構和表面活性。HN-87、HH-53、HN-48和HH-44界面蛋白含有較高的表面疏水性基團，而HN-69、HN-66、HN-52和HN-61界面蛋白的表面疏水性較低，這與蛋白在水油界面的穩定性相關。界面蛋白的折疊結構減少，使埋藏在分子內部的疏水性位點暴露出來，吸附在水油界面深入到油相內部，形成比較牢固的蛋白膜來穩定乳液，提高蛋白質的乳化性能。文獻[40]的研究結果同樣表明，當蛋白分子更易舒展，柔性較高時，其疏水性相對較高，一定程度上維持乳液的穩定。

2.6 二硫鍵含量分析

不同品種界面蛋白的二硫鍵含量如圖4所示。二硫鍵對于穩定蛋白質起重要作用，一般二硫鍵數目越多，蛋白結構的穩定性越強，柔性較差[41]。HN-87、HH-53、HN-48和HH-44界面蛋白二硫鍵含量較高，其他品種的界面蛋白也存在較大差異(P>0.05)。這是由于二硫鍵存在于蛋白質分子內和分子間。在界面蛋白吸附到油滴表面形成蛋白膜，這些蛋白質分子間就通過二硫鍵結合，才能形成穩定的蛋白質，增強膜的強度。與此同時，蛋白質中的疏水殘基多數圍繞蛋白質中的二硫鍵形成疏水區域[42]，這也導致界面蛋白形成穩定的乳液。

2.7 界面蛋白熒光光譜分析

由于蛋白分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基能夠吸收發射熒光，而色氨基殘基的變化程度及其微環境情況反映了蛋白質的結構變化。由圖5可以看出，不同品種大豆界面蛋白的最大吸收峰均大于330 nm，說明所有界面蛋白的色氨酸殘基均分布在蛋白質分子外部極性環境中。HH-51、HN-61、HN-66和HN-69界面蛋白的最大吸收峰小于330 nm，說明這4種界面蛋白的更多色氨酸殘基位于蛋白質分子內部，結構柔性較低，不易打開暴露。HH-53、HN-52和HH-49界面蛋白的最大吸收峰位于330 nm，而HN-87、HN-85、HN-48、JY-55和HH-44界面蛋白吸收峰大于330 nm，均出現了紅移現象，說明這些界面蛋白的結構柔性較高，更易伸展暴露，使更多的色氨酸殘基暴露在蛋白質分子的外部，形成疏水殘基，使得界面蛋白柔性更高，更易吸附在水-油界面，防止油滴聚集，從而穩定乳液。由于紅移的程度反映蛋白質構象的差異程度，紅移程度越大，說明蛋白質色氨酸極性越強，導致蛋白質表面疏水性越大[43]。所以HN-48、HH-44和JY-55界面蛋白的紅移幅度更大，說明蛋白分子結構更加松散，結構柔性更強，更易暴露內部的氨基酸殘基。這與界面蛋白表面疏水性的結果一致。

2.8 界面蛋白紫外-可見吸收光譜

紫外-可見吸收光譜是一種非常簡單、實用的，用于探究蛋白質結構的方法。由于蛋白質側鏈含有的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基等芳香族氨基酸，會產生不同的紫外吸收峰，從而反映蛋白質的三級構象的變化[44]。由圖6可知，界面蛋白在290 nm左右處出現了峰值。HN-69、HN-61、HH-51和HH-44界面蛋白的峰值低于其他品種的界面蛋白，界面蛋白發生了紅移，說明蛋白質中的酪氨酸更多地暴露于極性環境中，而色氨酸更多地趨向于埋藏在蛋白質分子內部。

2.9 界面蛋白溶解性

蛋白質的溶解性與乳化性質有著密切關系，不同品種界面蛋白的溶解性如圖7所示。12種界面蛋白的溶解性較差，且具有顯著性差異(P<0.05)。由于界面的提取是從蛋白質乳液中分離得到的，含有少部分的油脂殘存。另外，界面蛋白的結構特征表明，界面蛋白結構穩定，且含有較多的疏水性氨基酸，使得溶解性降低。這與上述對界面蛋白的表面疏水性的分析結果相同。

2.10 界面蛋白乳化性質

柔性較高的HN-87、HH-44、HH-53和HN-48界面蛋白表現出更好的界面性質(圖8)。不同品種界面蛋白的乳化穩定性差異不大，較分離蛋白相比有所降低。這可能是由于界面提取后蛋白質的結構發生了變化，在穩定蛋白膜上失去了原本穩定的結構，導致乳化穩定性降低。對比前期對大豆分離蛋白的乳化性質的測定[31]，進一步確定界面蛋白是柔性最高的柔性蛋白，表面擁有較高的疏水性基團，有利于吸附在水油界面，增加蛋白質分子間的相互作用。文獻[45]的研究結果表明，表面疏水性是影響分析蛋白質乳化性質的主要參數，本文研究結果與其相吻合。結合上述界面蛋白結構特征的分析，可以確定蛋白質結構的改變會極大影響界面學性質。

3 結束語

探究了不同品種大豆界面蛋白的結構特征和界面學性質。結果表明：柔性蛋白更易吸附到水油界面，且增加界面蛋白的吸附量，形成的乳液穩定性增加。這與其氨基酸組成存在相關性，疏水性氨基酸含量決定了柔性界面蛋白與水分子的相互作用，與表面疏水性呈現相同趨勢。界面蛋白的α-螺旋結構含量較低，無規則卷曲結構含量增加。界面蛋白中7S亞基的柔性較高。紫外光譜和熒光光譜分析表明，柔性界面蛋白分子的結構易伸展，使內部的疏水性基團暴露出來，且界面蛋白分子的二硫鍵多在疏水基團附近形成，從而降低了界面蛋白的溶解性，增加其界面學性質。