MUS81基因多態(tài)性與EBV相關(guān)腫瘤的相關(guān)性

[摘要]"目的 探討MUS81基因多位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與EB病毒（EBV）相關(guān)腫瘤的關(guān)系。方法 采用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，分別檢測(cè)鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌等腫瘤組織和正常對(duì)照人群外周血MUS81基因rs13817、rs648732、rs659857位點(diǎn)基因型，并分別分析EBV陽(yáng)性腫瘤、EBV陰性腫瘤、正常對(duì)照人群MUS81基因上述位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的差異。結(jié)果 EBV陽(yáng)性胃癌rs13817位點(diǎn)基因型AA、等位基因A和rs648732位點(diǎn)等位基因T頻率均明顯高于正常對(duì)照（χ2=4.917～6.802，P<0.05）;EBV陽(yáng)性胃癌和鼻咽癌rs659857位點(diǎn)TC基因型頻率明顯低于正常對(duì)照和（或）相應(yīng)的EBV陰性腫瘤（χ2=14.759～28.741，P<0.01），EBV陽(yáng)性和陰性淋巴瘤rs659857位點(diǎn)TC基因型頻率明顯低于正常對(duì)照（χ2=14.124、16.455，P<0.01）。結(jié)論 MUS81基因rs13817、rs648732和rs659857位點(diǎn)多態(tài)性與EBV相關(guān)腫瘤存在相關(guān)性，是其潛在的風(fēng)險(xiǎn)因素。

[關(guān)鍵詞]"MUS81基因;多態(tài)性，單核苷酸;胃腫瘤;鼻咽癌;淋巴瘤;皰疹病毒4型，人

[中圖分類號(hào)]"R394.25;R73

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]"A

[文章編號(hào)]"2096-5532（2021）04-0555-04

EB病毒（EBV）屬人類皰疹病毒4型，感染全球超過(guò)95%的成年人[1]。EBV感染與多種人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等[2-3]。EBV相關(guān)腫瘤組織中，幾乎所有的腫瘤細(xì)胞均可檢測(cè)到EBV基因組，且其末端重復(fù)序列的數(shù)目均相同，提示EBV感染發(fā)生在腫瘤形成的早期[4]，但EBV誘導(dǎo)腫瘤形成的細(xì)胞及分子機(jī)制尚不明了。誘導(dǎo)宿主細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定是EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，EBV潛伏感染往往伴隨著DNA損傷修復(fù)失調(diào)引起的非克隆性染色體異常[5-6]。MUS81基因是新近發(fā)現(xiàn)的重要的DNA損傷修復(fù)基因，在乙烷磺酸鹽和紫外線引起的DNA損傷的識(shí)別、修復(fù)以及維持DNA復(fù)制穩(wěn)定中發(fā)揮著重要的作用[7]。多項(xiàng)研究證實(shí)，MUS81基因異常表達(dá)與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8-10]。基因多態(tài)性，如單核苷酸多態(tài)性（SNP），可能通過(guò)對(duì)DNA損傷修復(fù)基因的調(diào)控影響不同個(gè)體對(duì)腫瘤的易感性而導(dǎo)致相關(guān)腫瘤的發(fā)生[11]，已被廣泛用作診斷和評(píng)估某些疾病和腫瘤風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后的生物標(biāo)記物。但目前尚未見(jiàn)MUS81基因多態(tài)性與胃癌、鼻咽癌、淋巴瘤及病毒感染相關(guān)性報(bào)道。因此，本研究選取3個(gè)MUS81基因高突變多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析，探討其與EBV相關(guān)腫瘤的相關(guān)性。

1"材料與方法

1.1"組織標(biāo)本

本研究所用胃癌、鼻咽癌、淋巴瘤腫瘤標(biāo)本共計(jì)403例，均來(lái)自青島大學(xué)附屬醫(yī)院和青島市市立醫(yī)院病理科，包括胃癌組織標(biāo)本158例，病人男136例，女22例，平均年齡（56.39±11.33）歲;鼻咽癌組織標(biāo)本104例，病人男76例，女28例，平均年齡（46.24±15.01）歲;淋巴瘤組織標(biāo)本141例，病人男83例，女58例，平均年齡（46.71±18.89）歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。隨機(jī)選取113例健康成人乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝外周血5 mL作為正常對(duì)照（NC），經(jīng)離心分離取單核細(xì)胞并提取DNA備用。

1.2"EBV陽(yáng)性腫瘤的鑒定

采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)石蠟包埋組織標(biāo)本中EBV編碼小RNA1（EBER1），EBER1特異性寡核苷酸反義探針（AGACACCGTCCTCACCACCCG-GGACTTGTA）參考文獻(xiàn)方法設(shè)計(jì)并由Roche公司合成[12]。采用Roche公司Dig Oligonucleotide 3′-end Labeling kit標(biāo)記，陽(yáng)性者為EBV陽(yáng)性標(biāo)本。

1.3"DNA提取

采用蛋白酶K消化和酚-氯仿法提取外周血與新鮮組織標(biāo)本DNA，石蠟包埋組織DNA抽提試劑盒（QIAGEN，德國(guó)）提取石蠟包埋組織的DNA。采用NanoPhotometer P360（IMPLEN，德國(guó)）檢測(cè)各樣本DNA濃度和純度，所有樣本DNA濃度需介于0.05～0.50 g/L之間，以滿足飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)要求。

1.4"基因多態(tài)性檢測(cè)

所有DNA樣本均送華大基因公司，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)MUS81基因rs13817、rs648732和rs659857位點(diǎn)的基因型，引物序列和延長(zhǎng)探針序列見(jiàn)表1。

1.5"統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 24.0（IBM）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)間比較采用卡方檢驗(yàn)和Fisher精確概率檢驗(yàn)（雙側(cè)），以P<0.05為差異有顯著性。用比值比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）表示等位基因的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)。

2"結(jié)"果

本研究EBER1原位雜交篩選出EBV陽(yáng)性胃癌（EBVaGC）48例、EBV陽(yáng)性鼻咽癌（EBVaNPC）49例和EBV陽(yáng)性淋巴瘤（EBVaL）93例。本研究對(duì)照組中MUS81基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。

2.1"rs13817位點(diǎn)與胃癌、鼻咽癌和淋巴瘤相關(guān)性

EBVaGC rs13817位點(diǎn)基因型分布與NC相比差異有顯著性（χ2=7.183，P<0.05），EBVaGC基因型AA的頻率（16.67%）較NC明顯升高（OR=4.320，95%CI=1.334～13.986，P=0.009），而其他組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示基因型AA可能是EBVaGC的危險(xiǎn)因素。EBVaGC rs13817位點(diǎn)等位基因A的頻率顯著高于NC（χ2=4.917，P<0.05），而EBV陰性胃癌（EBVnGC）與NC比較以及EBVaGC與EBVnGC比較差異均無(wú)顯著意義（P>0.05），結(jié)果提示等位基因A可能是EBVaGC危險(xiǎn)因素。EBVaNPC、EBV陰性鼻咽癌（EBVnNPC）、EBVaL和NC各組比較，rs13817位點(diǎn)基因型和等位基因頻率差異均無(wú)顯著性（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.2"rs648732位點(diǎn)與胃癌、鼻咽癌和淋巴瘤相關(guān)性

EBVaGC、EBVnGC、EBVaNPC、EBVnNPC、EBVaL、EBV陰性淋巴瘤（EBVnL）與NC相比較，rs648732位點(diǎn)基因型分布差異均無(wú)顯著性（P>0.05）。EBVaGC T等位基因的頻率顯著高于NC（OR=1.818，95%CI=1.093～3.025，P=0.021），提示rs648732位點(diǎn)等位基因T可能是EBVaGC的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3。

2.3"rs659857位點(diǎn)與胃癌、鼻咽癌和淋巴瘤相關(guān)性

本研究EBVaGC rs659857位點(diǎn)基因型分布與EBVnGC、NC比較差異均有顯著意義（χ2=25.077、28.741，P<0.01），其雜合基因型TC明顯缺失。EBVaNPC TC基因型頻率低于NC（χ2=14.759，P<0.01），與EBVnNPC比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）。EBVaL和EBVnL TC基因型頻率與NC比較差異均有顯著性（χ2=14.124、16.455，P<0.01），而EBVaL與EBVnL比較則差異無(wú)顯著意義（P>0.05）。上述結(jié)果提示，雜合基因型TC減少可能為上述腫瘤的危險(xiǎn)因素。EBVaNPC、EBVaL、EBVnL的T等位基因頻率均明顯高于NC（χ2=7.141～9.416，P<0.01），提示等位基因T可能為上述腫瘤的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

3"討"論

腫瘤的形成受多種因素的影響，例如微生物因素、個(gè)體的易感性、毒物、生活習(xí)慣等，基因不穩(wěn)定也是其中一個(gè)重要的因素。誘導(dǎo)宿主細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定是EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，EBV潛伏感染過(guò)程中往往伴隨著DNA損傷修復(fù)失調(diào)引起的染色體異常[5-6]。研究證實(shí)，重要的DNA損傷修復(fù)基因SNP對(duì)個(gè)體腫瘤的易感性有重要的影響[11，13]。LOIZIDOU等[14]研究表明，MUS81基因rs545500位點(diǎn)的SNP可使該位點(diǎn)的氨基酸從精氨酸變成脯氨酸殘基，能夠提示乳癌發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，部分位點(diǎn)的SNP能夠增加病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，是某些病毒相關(guān)疾病的危險(xiǎn)因素[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，EBVaGC rs13817位點(diǎn)基因型AA和等位基因A頻率明顯高于正常對(duì)照，提示兩者可能是EBVaGC的危險(xiǎn)因素。同樣，EBVaGC rs648732位點(diǎn)等位基因T頻率明顯高于正常對(duì)照，提示該位點(diǎn)等位基因T可能為EBVaGC的危險(xiǎn)因素。胃癌發(fā)生與基因多態(tài)性的關(guān)系已有文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]，而近年來(lái)，亦有胃癌基因多態(tài)性與EBV感染相關(guān)性的研究報(bào)道[19-20]。EBVaGC的發(fā)病機(jī)制和臨床病理特征均異于EBVnGC，EBV潛伏感染是其重要致病機(jī)制。本文結(jié)果表明，MUS81基因多態(tài)性與EBV相關(guān)胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究未顯示MUS81基因rs13817、rs648732位點(diǎn)多態(tài)性與鼻咽癌、淋巴瘤及其EBV潛伏感染有明顯相關(guān)性。

本文結(jié)果還顯示，在EBVaGC及EBVaNPC中，MUS81基因rs659857位點(diǎn)雜合基因型TC明顯減少，而在EBV陽(yáng)性和陰性淋巴瘤中均存在此現(xiàn)象，提示在EBV相關(guān)上皮細(xì)胞性腫瘤中，rs659857位點(diǎn)與EBV潛伏感染密切相關(guān)，而在淋巴細(xì)胞性腫瘤中則與EBV感染無(wú)關(guān)。推測(cè)這種現(xiàn)象可能與腫瘤的發(fā)病機(jī)制不同相關(guān)，鼻咽癌和胃癌為上皮細(xì)胞性腫瘤，而淋巴瘤為淋巴細(xì)胞性腫瘤，且其分型較多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[21-23]。目前已有多項(xiàng)研究結(jié)果表明，SNP可能參與淋巴瘤的形成且與EBV潛伏感染密切相關(guān)[24]。HLA-DPB1基因附近rs6457715位點(diǎn)的多態(tài)性與霍奇金淋巴瘤及EBV潛伏感染相關(guān)，該區(qū)域可能是一個(gè)新的霍奇金淋巴瘤易感位點(diǎn)[25]。特殊位點(diǎn)的雜合型缺失能夠引起某些抑癌基因的失活從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[26]。盡管這種雜合型缺失在多種實(shí)體腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，但具體的分子機(jī)制仍不清楚。依據(jù)本研究結(jié)果，推測(cè)在上皮細(xì)胞性腫瘤鼻咽癌和胃癌中，rs659857位點(diǎn)的雜合型缺失與EBV的潛伏感染可能共同作用參與腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，本研究首次探討了MUS81基因多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與EBV相關(guān)腫瘤的相關(guān)性，結(jié)果表明，rs13817、rs648732和rs659857位點(diǎn)多態(tài)性與EBV相關(guān)腫瘤存在相關(guān)性，MUS81基因的多態(tài)性可作為EBV相關(guān)腫瘤的標(biāo)志物。

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（本文編輯"馬偉平）