miR-21-5p調控FGF18表達對結腸癌腫瘤干細胞生物學行為影響

[摘要] 目的 探究miR-21-5p調控成纖維細胞生長因子18（FGF18）表達對結腸癌腫瘤干細胞生物學行為作用及機制。

方法 應用流式細胞分選術篩選CD133+/CD44+結腸癌干細胞，并行細胞培養、分組及質粒轉染。分別應用CCK-8法、Transwell小室法、流式細胞術檢測細胞增殖、遷移和侵襲能力及凋亡率。應用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-21-5p及FGF18 mRNA表達水平，Western blotting檢測CD44、CD133和FGF18蛋白表達水平。

結果 FGF18為miR-21-5p靶基因。與空白（Blank）組和陰性對照（NC）組相比，miR-21-5p模擬物（miR-21-5p mimic）組CD133+/CD44+細胞增殖抑制率和凋亡率顯著降低，遷移、侵襲能力顯著提升，CD44、CD133和FGF18表達水平顯著上升（F=11.23～886.10，P均lt;0.05）;miR-21-5p抑制劑（miR-21-5p inhibitor）組和FGF18沉默表達（si-FGF18）組細胞增殖抑制率和凋亡率顯著升高，遷移、侵襲能力顯著降低，CD44、CD133和FGF18表達水平顯著下調（F=10.23～764.70，P均lt;0.05）;而si-FGF18+miR-21-5p mimic組與Blank組和NC組比較差異無統計學意義（P均gt;0.05）。

結論 下調miR-21-5p表達并沉默FGF18表達，可抑制結腸癌腫瘤干細胞增殖、遷移和侵襲，并促進其凋亡。

[關鍵詞] 結腸腫瘤;腫瘤干細胞;微RNAs;基因，FGF18;基因沉默;細胞增殖;細胞凋亡;細胞運動

[中圖分類號] R735.35;R342.2

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）06-0886-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.191

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211229.1628.004.html;2021-12-30 14：25：24

EFFECT OF MIR-21-5P ON THE BIOLOGICAL BEHAVIOR OF COLON CANCER STEM CELLS BY REGULATING THE EXPRESSION OF FIBROBLAST GROWTH FACTOR 18

XI Xiaozhong， LI Guoqiang， XIAO Lei， YAO Kunhou

（Department of Oncological Surgery， Xinyang Central Hospital， Xinyang 464000， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of miR-21-5p on the biological behavior of colon cancer stem cells by regulating the expression of fibroblast growth factor 18 （FGF18） and related mechanism.

Methods Flow cytometry sorting was used to screen out CD133+/CD44+ colon cancer stem cells， and cell culture， grouping， and plasmid transfection were performed. CCK-8 assay， Transwell chamber assay， and flow cytometry were used to measure cell proliferation/migration/invasion abilities and cell apoptosis. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression levels of miR-21-5p and FGF18， and Western blotting was used to measure the protein expression levels of CD44， CD133， and FGF18.

Results FGF18 was the target gene of miR-21-5p. Compared with the blank group and the negative control （NC） group， the miR-21-5p mimic group had significant reductions in the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of CD133+/CD44+ cells and significant increases in the migration and invasion abilities of CD133+/CD44+ cells， as well as significant increases in the expression levels of CD44， CD133， and FGF18 （F=11.23-886.10，Plt;0.05）; the miR-21-5p inhibitor group and the si-FGF18 group had significant increases in the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of CD133+/CD44+ cells， significant reductions in the migration and invasion abilities of CD133+/CD44+ cells， and significant reductions in the expression levels of CD44， CD133， and FGF18 （F=10.23-764.70，Plt;0.05）; there were no significant differences between the si-FGF18+miR-21-5p mimic group and the blank/NC groups （Pgt;0.05）.

Conclusion Downregulating the expression of miR-21-5p and silencing the expression of FGF18 can inhibit the proliferation， migration， and invasion of colon cancer stem cells and promote their apoptosis.

[KEY WORDS]colonic neoplasms; neoplastic stem cells; microRNAs;genes， FGF18; gene silencing; cell proliferation; apoptosis; cell movement

結腸癌是消化道癌癥主要表型，其惡性程度較高[1]，病死率位居惡性腫瘤前列，且呈逐年上升趨勢，地域和人群差異顯著[2]。研究表明，腫瘤干細胞分離和鑒定極大地推動了實體腫瘤如肺癌、消化道癌、生殖系統癌癥等的深入研究[3-5]。細胞表面標志物，如CD133、CD44等，已被廣泛用于各類惡性腫瘤干細胞的鑒定，如消化道癌等[6]。此外，miRNA是一類可以通過阻斷mRNA翻譯或者降解目標mRNA，從而發揮基因抑制的內源性非編碼的小RNA。miRNA異常表達已被證實與癌細胞增殖、凋亡及轉移等關聯密切，并參與惡性腫瘤進程，其中miR-21在結腸癌中高表達[7]。本研究基于生物學預測網站發現成纖維細胞生長因子18（FGF18）為促癌基因[8]，是miR-21-5p靶基因之一，然而有關其在結腸癌中的研究尚未見報道。基于此，本研究主要探究了miR-21-5p調控FGF18表達對結腸癌腫瘤干細胞增殖、遷移和侵襲的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

結腸癌HT29細胞（中國科學院上海細胞生物學研究所提供）;胰蛋白酶（Hyclone公司，USA）;DMEM/F12培養基（Gibco公司，USA）;細胞轉染序列（上海奇駿牛物科技有限公司）;分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）;倒置光學顯微鏡（寧波舜宇光學科技（集團）有限公司）;細胞凋亡檢測試劑盒（Sigma公司，USA）;miR-21-5p、FGF18引物合成（Takara，大連寶生物工程有限公司）;熒光定量PCR儀（ABI，USA）;BCA試劑盒（廣州威佳生物科技有限公司）;Western blotting試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 CD133+/CD44+結腸癌干細胞分選 將結腸癌HT29細胞進行常規消化，參照既往文獻的方法[9]，采用流式細胞分選技術分離篩選CD133+/CD44+結腸癌干細胞。將分選后細胞重懸，在37 ℃、含體積分數0.05 CO 2條件下于6孔板中培養。以供后續細胞增殖、遷移和侵襲及凋亡等實驗應用。

1.2.2 CD133+/CD44+細胞培養、分組及質粒轉染

觀察CD133+/CD44+細胞的生長狀況，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO 2條件下繼續培養。細胞傳代培養過程中，對細胞進行離心和消化處理，吹打成單個細胞。重復上述操作，離心、棄細胞沉淀，吹打混勻成單細胞懸液后，轉至6孔板相同條件繼續培養備用。選取傳代后3～5 d處于對數生長期的狀態良好的細胞凍存備用。

取細胞分為如下6組：空白對照組（A組，Blank組）、陰性對照組（B組，NC組）、miR-21-5p模擬物組（C組，miR-21-5p mimic組）、miR-21-5p抑制劑組（D組，miR-21-5p inhibitor組）、FGF18沉默表達組（E組，si-FGF18組）、FGF18沉默表達+ miR-21-5p模擬物組（F組，si-FGF18+miR-21-5p mimic組）。按照不同分組轉染質粒，具體轉染操作如下。①Blank組：不轉染任何序列。②NC組：轉染空白質粒。③miR-21-5p mimic組：轉染miR-21-5p mimic質粒。④miR-21-5p inhibitor組：轉染miR-21-5p inhibitor質粒。⑤si-FGF18組：轉染si-FGF18質粒。⑥si-FGF18+miR-21-5p mimic組：轉染si-FGF18和 miR-21-5p mimic質粒。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 細胞增殖測定根據細胞計數試劑盒說明書進行操作。取各組轉染細胞混懸液加入96孔板中，每組設6個復孔，置于常規細胞培養箱培養。每孔加入CCK8溶液10 μL，繼續培養。采用分光光度計測量450 nm波長處吸光度值，計算細胞增殖抑制率。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞的遷移和侵襲能力 取各組轉染細胞，消化離心后重懸計數。按常規操作程序分別進行細胞遷移和侵襲實驗。細胞遷移實驗步驟如下：細胞培養后取Transwell小室，使用40 g/L多聚甲醛固定，5 g/L結晶紫溶液染色并拭去未遷移細胞，光學顯微鏡下觀察并求取平均值。細胞侵襲實驗過程中，應用Matrigel稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室，并在37 ℃條件下將實驗樣品自然風干，其余操作同細胞遷移實驗。比較各組細胞遷移和侵襲能力。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 各組細胞轉染48 h后收集細胞于流式管，胰蛋白酶消化液處理細胞，低溫離心處理后調節細胞密度。采集細胞懸液，按照Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明進行操作，檢測細胞凋亡率。

1.2.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-21-5p表達及FGF18 mRNA表達 經細胞RNA沉淀、洗滌、溶解和濃度測定后，分別提取各組轉染后CD133+/CD44+細胞總RNA。將RNA逆轉錄成cDNA，參照說明書進行。取反應液進行熒光定量PCR，參照說明書進行操作。采用相對定量法分別計算目的基因miR-21-5p和FGF18相對于內參照（U6）的相對表達量。

1.2.7 Western blotting檢測CD133、CD44以及FGF18蛋白表達 待細胞生長至匯合狀態（80%），收集細胞加入裂解緩沖液，離心處理后提取各組CD133+/CD44+細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。根據不同濃度進行定量，待樣本處理完畢后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉膜、室溫下脫脂奶粉中置于搖床中封閉。滴加一抗兔抗人CD133、CD44和鼠抗人FGF18，4 ℃過夜，PBS洗滌，然后應用HRP標記的羊抗兔IgG抗體孵育（全程避光）。內參照為GAPDH。顯影和定影后，采用Image J系統分析計算蛋白相對含量。

1.3 統計學分析

采用SPSS 18.0統計學軟件進行分析。計量資料數據采用±s形式表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗。以Plt;0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 miR-21-5p與FGF18靶向關系

通過在線分析軟件分析顯示，FGF18基因與miR-21-5p序列間存在特異結合區域（圖1），確定FGF18是miR-21-5p的靶基因。這一靶向關聯為本文細胞實驗奠定理論基礎。

2.2 miR-21-5p調控FGF18表達對結腸癌干細胞增殖的影響

CCK-8檢測結果顯示，與Blank組和NC組相比，miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細胞增殖抑制率明顯降低（F=16.28，Plt;0.05），miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18組明顯升高（F=26.53、23.96，P均lt;0.05），si-FGF18+miR-21-5p mimic組無明顯差異（Pgt;0.05）。而與si-FGF18組相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細胞增殖抑制率下降，差異有顯著性（t=6.181，Plt;0.05）。見表1。

2.3 miR-21-5p調控FGF18表達對結腸癌干細胞遷移和侵襲影響

Transwell實驗結果顯示，與Blank組和NC組相比，miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細胞遷移和侵襲能力顯著升高;miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18組細胞遷移和侵襲能力顯著降低，差異具有統計學意義（F 遷移=11.23～19.55，F 侵襲=21.68～52.85，P均lt;0.05）;si-FGF18+miR-21-5p mimic組細胞遷移和侵襲能力無明顯差異（P均gt;0.05）。而與si-FGF18組細胞相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic組細胞遷移和侵襲能力明顯上升（t=4.927、8.073，P均lt;0.05）。見圖2。

2.4 miR-21-5p調控FGF18表達對結腸癌干細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，與Blank組和NC組相比，miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細胞早、晚期凋亡率呈下降趨勢;而miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18組凋亡率則上升（F 早期=17.22～35.88，F 晚期=24.12～109.80，P均lt;0.05）;si-FGF18+miR-21-5p mimic組凋亡率差異無顯著性（P均gt;0.05）。

而與si-FGF18組相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細胞早、晚期凋亡下降（t=10.73、13.47，P均lt;0.05）。見表1。

2.5 miR-21-5p調控FGF18表達對miR-21-5p和FGF18相對表達影響

qRT-PCR檢測結果顯示，與Blank組和NC組相比，miR-21-5p mimic組FGF18 mRNA和miR-21-5p的表達水平均顯著上升，miR-21-5p inhibitor組FGF18 mRNA和miR-21-5p表達水平均顯著下調（F FGF18=29.44、886.10， F miR-21-5p=12.18、764.70，P均lt;0.05）;si-FGF18組miR-21-5p表達差異無顯著性（Pgt;0.05），而FGF18 mRNA表達水平顯著下降（F=32.90，Plt;0.05）;且si-FGF18+miR-21-5p mimic組miR-21-5p表達水平顯著上升（F=509.10，Plt;0.05），而FGF18表達無顯著差異（Pgt;0.05）。見表1。

2.6 miR-21-5p調控FGF18表達對CD44、CD133和FGF18蛋白表達影響

Western blotting結果顯示，與Blank組和NC組細胞相比較，miR-21-5p mimic組CD44、CD133和FGF18蛋白表達水平均顯著上升（F=109.00～551.90，P均lt;0.05）;miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18組的蛋白表達水平則顯著下降（F=9.31～36.45， P均lt;0.05），si-FGF18+miR-21-5p mimic組的蛋白表達水平無明顯變化（P均gt;0.05）。與si-FGF18組相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic組CD44、CD133和FGF18表達均呈上升趨勢（t=3.253～10.18，P均lt;0.05）。見圖3。

3 討論

本研究首先通過生物學預測軟件確定FGF18是miR-21-5p的靶基因。進而采用細胞培養并構建質粒轉染方法，探究miR-21-5p調控FGF18表達對結腸癌腫瘤干細胞生物學行為的影響。本研究選用流式細胞分選技術篩選CD133+/CD44+結腸癌干細胞的臨床意義在于，上皮來源的惡性腫瘤的發生可能與腫瘤干細胞的增殖、分化等潛能存在關聯性[10]。針對腫瘤細胞的惡性特征，既往眾多研究已發現腫瘤的進程可歸因于腫瘤干細胞的特征，如其可自我更新、增殖分裂等，從而導致腫瘤細胞的耐藥性、治療失敗、癌癥復發等不良后果。腫瘤治療多采用外源性干預手段抑制此類干細胞的自我更新，從而阻斷細胞增殖、誘導細胞凋亡，最終實現逆轉腫瘤細胞增殖分化、轉移等[11]。作為腫瘤細胞的標志物，CD133、CD44已被證實在肝癌、骨肉瘤等中呈顯著高表達，其表達上調可能與激活下游信號通路、抑制腫瘤細胞凋亡等相關聯[12-13]。另外，miR-21-5p已被報道與人類消化道癌癥等密切相關[14-15]，并通過作用眾多的基因靶點參與腫瘤進展，為腫瘤靶向治療提供新途徑。WU等[16]研究顯示，miR-21-5p高表達可通過抑制PTEN、激活P13K/Akt信號通路、誘導上皮間質轉化等機制促進食管癌發生進程。因此，作者推測miR-21-5p有可能通過特定靶基因，干預結腸癌干細胞生物學進程。FGF18作為成纖維細胞因子，屬于纖維細胞因子（FGF）家族，是典型的促癌基因。FGF家族成員在血管生成、組織細胞增殖、成纖維細胞增生等方面發揮重要作用，通過翻譯轉錄可發揮多種潛在功能[17]。FGF18在癌癥中呈高表達，如在卵巢高級漿膜癌中呈顯著高表達，促進癌癥進展[18]。

本研究結果表明，下調miR-21-5p表達和沉默FGF18表達后CD133+/CD44+細胞增殖抑制率和凋亡率顯著提升，而遷移和侵襲能力顯著降低;而上調miR-21-5p表達結果與此相反;且在上調miR-21-5p表達基礎上沉默FGF18表達，逆轉了沉默FGF18表達對細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的作用。本文結果提示，miR-21-5p低表達可在結腸癌干細胞增殖、遷移和轉移中發揮正向作用;同時，下調miR-21-5p表達可抑制FGF18表達，進一步凸顯了對結腸癌干細胞生物學行為的調控作用。此外，上調miR-21-5p表達后導致FGF18、CD133、CD44蛋白表達水平顯著上升;而下調miR-21-5p表達，靶向抑制FGF18，上述因子的表達水平均顯著逆轉。就其機制而言，微小RNA通常通過靶基因調節轉錄后表達。我們推測其可能與FGF18為miR-21-5p靶基因，miR-21-5p通過與其3′端非翻譯區特異性結合，抑制作為促癌基因FGF18的表達水平，從而達到抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡的結果。LU等[19]報道，過表達miR-21-5p可靶向15-PGDH，促進膽管癌生長。YAN等[20]亦在其研究中通過基因組微陣列數據和靶向預測miR-21-5p可靶向PIK3R1，抑制腫瘤細胞遷移和侵襲，降低PI3K/AKT信號轉導并逆轉上皮間質轉化，在乳癌中發揮重要作用。本研究亦通過類似機制性探討，初步顯示miR-21-5p與其靶基因FGF18在結腸癌腫瘤干細胞中的作用，為臨床探究結腸癌治療提供了一定的實驗依據。

綜上所述，本研究證實抑制miR-21-5p表達并沉默FGF18表達，可抑制結腸癌腫瘤干細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。本實驗為靶向miR-21-5p和FGF18的分子治療策略提供了實驗基礎。同時，本研究有待進一步的動物移植瘤實驗驗證，并佐以進一步的實驗探究抑制miR-21-5p表達對腫瘤細胞藥物敏感性以及臨床病人預后方面的影響。

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（本文編輯 于國藝）