EBNA1對EBV相關胃癌細胞中E2F1表達的影響

[摘要] 目的 探討EB病毒（EBV）相關胃癌（EBVaGC）細胞中EBV編碼的核抗原1（EBNA1）對E2F轉錄因子1（E2F1）表達的調控作用，并分析EBNA1和E2F1在胃癌細胞的表達情況。

方法 應用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）以及Western blotting方法，檢測EBVaGC和EBV陰性胃癌（EBVnGC）細胞中EBNA1和E2F1的mRNA和蛋白表達水平;選取兩種EBVnGC細胞BGC823和SGC7901，建立EBNA1穩定表達的細胞模型，命名為BGC823-EBNA1和SGC7901-EBNA1，采用qRT-PCR方法和Western blotting方法檢測兩種細胞中E2F1 mRNA和蛋白表達水平。

結果 qRT-PCR和Western blotting結果顯示，EBNA1只在EBVaGC細胞中表達。EBVaGC細胞的E2F1 mRNA表達水平明顯高于EBVnGC細胞，差異有統計學意義（t=13.60，Plt;0.01）;而兩種細胞的E2F1蛋白表達水平差異無顯著性（Pgt;0.05）。在EBVnGC細胞中穩定過表達EBNA1后E2F1的mRNA和蛋白表達明顯上調。

結論 EBV編碼EBNA1誘導E2F1表達上調，提示E2F1可能在EBVaGC的發生發展中起著重要作用。靶向EBNA1/E2F1途徑可能為EBVaGC病人的治療提供新的治療靶點。

[關鍵詞] 皰疹病毒4型，人;胃腫瘤;EBV編碼的核抗原1;E2F轉錄因子1

[中圖分類號] R373.9

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）06-0860-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.166

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210909.1515.005.html;2021-09-09 18：14：34

EFFECT OF EBNA1 ON E2F1 EXPRESSION IN EBV-ASSOCIATED GASTRIC CARCINOMA CELLS

SONG Hui， QIN Ni， YU Caixia， SHI Duo， LIU Wen

（Department of Pathogenic Biology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To explore the regulatory effect of Epstein-Barr nuclear antigen 1 （EBNA1） encoded by Epstein-Barr virus （EBV） on the expression of E2F transcription factor 1 （E2F1） in EBV-associated gastric carcinoma （EBVaGC） cells， and to analyze the expression of EBNA1 and E2F1 in gastric carcinoma cells.

Methods Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） and Western blotting were used to determine the mRNA and protein expression levels of EBNA1 and E2F1 in EBVaGC and EBV-negative gastric carcinoma （EBVnGC） cells. Two types of EBVnGC cells， BGC823 and SGC7901， were selected to establish cell models of stable EBNA1 expression， which were named BGC823-EBNA1 and SGC7901-EBNA1， respectively; qRT-PCR and Western blotting were used to determine the mRNA and protein expression levels of E2F1 in the cells.

Results The qRT-PCR and Western blotting results showed that EBNA1 was expressed only in EBVaGC cells. The mRNA expression level of E2F1 in EBVaGC cells was significantly higher than that in EBVnGC cells （t=13.60，Plt;0.01）， while there was no significant difference in E2F1 protein expression level between the two types of cells （Pgt;0.05）. After stable EBNA1 overexpression in EBVnGC cells， the mRNA and protein expression levels of E2F1 were significantly upregulated.

Conclusion EBV-encoded EBNA1 induces upregulation of E2F1 expression， which suggests that E2F1 may play an important role in the development and progression of EBVaGC. Targeting the EBNA1/E2F1 pathway may provide a new therapeutic target for EBVaGC patients.

[KEY WORDS]herpesvirus 4， huaman; stomach neoplasms; EBV-encoded nuclear antigen 1; E2F transcription factor 1

EB病毒（EBV）是一種普遍存在的γ皰疹病毒，世界上絕大多數人都曾感染EBV并獲得適應性免疫。1964年，EBV首先在伯基特淋巴瘤中被發現[1]，隨后發現其與多種人類腫瘤相關，包括霍奇金淋巴瘤、未分化的鼻咽癌以及10%左右的胃癌 [2]。EBV在腫瘤細胞中表達多種潛伏基因，其中EBV編碼的核抗原1（EBNA1）是唯一一個在所有EBV相關腫瘤細胞中都表達的潛伏基因。EBNA1可以與多種細胞蛋白相互作用，進而調節相關基因的表達，并且對維持EBV的潛伏感染狀態起著重要作用。2014年，癌癥基因組圖譜（TCGA）將胃癌分為了4種分子亞型：EB病毒相關胃癌（EBVaGC）、微衛星不穩定型（MSI）、染色體不穩定型（CIN）和基因組穩定型（GS）等[3]。EBVaGC的單獨分類顯示其具有獨特的致癌機制，并提供了將EBV用作靶向治療胃癌的新生物標志物的機會。

E2F轉錄因子于1986年被首次發現，可與腺病毒E2啟動子相互作用[4]。目前，已發現8個E2F轉錄因子家族成員（E2F1～8），其中大多數與控制細胞周期有關，同時對細胞分化、凋亡和DNA損傷等也發揮重要作用。E2F轉錄因子1（E2F1）是第一個被鑒定的E2F家族成員，視網膜母細胞瘤蛋白（pRB）可與 E2F1相結合，進而抑制其活性[5]。多項研究顯示，E2F1在多種腫瘤組織和細胞中高表達，如肺癌、乳癌、前列腺癌等[6-8]。E2F1的表達與腫瘤的發生、發展、轉移及預后密切相關。然而，在胃癌中EBV對E2F1的調控及其作用機制，以及E2F1在胃癌中發揮的作用目前尚不明確。本文構建EBNA1穩定表達的細胞模型，檢測EBVaGC細胞、EBV陰性胃癌細胞（EBVnGC）及EBNA1穩定表達細胞中E2F1的表達，探討E2F1在EBVaGC中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

本研究采用了EBVaGC細胞系GT38、GT39和SNU719以及EBVnGC細胞系SGC7901、AGS和BGC823。所有的細胞系均加入含有體積分數0.10胎牛血清以及10 g/L青霉素-鏈霉素混合液的DMEM培養基，置于37 ℃、含有體積分數0.05 CO 2的加濕培養箱中培養。

1.2 實驗材料

DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司;青霉素-鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司;Lipofectamine 2000試劑購自德國Invitrogen公司;RIPA裂解液、SDS-loading buffer購自北京康為世紀科技有限公司;TRIzol購自美國Invitrogen公司;FastStart Essential DNA Green Master購自德國Roche公司;Anti-EBNA1抗體購自美國Santa公司;Anti-E2F1抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;Anti-β-actin抗體、HRP標記的兔IgG和鼠IgG抗體均購自Cell Signaling Technology公司。PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司）;Light Cycler 96熒光定量PCR儀（SN10700型，瑞士Roche公司）;SDS-PAGE垂直板型電泳儀、濕式蛋白轉膜儀（美國Bio-Rad公司）;Quantum-ST5型（凝膠成像系統，法國Vilber Lourmat公司）。

1.3 構建穩定表達EBNA1的細胞模型

選取EBVnGC細胞系BGC823和SGC7901，采用Lipofectamine 2000試劑分別轉染EBNA1重組質粒及其對照質粒（NC），轉染24 h后于熒光顯微鏡下觀察轉染效率。待細胞匯合度至90%左右時，采用1 g/L的嘌呤霉素（Puromycin）篩選穩定表達EBNA1的細胞，直至熒光細胞含量90%以上。收集細胞，應用Western blotting方法檢測EBNA1蛋白表達水平。EBNA1穩定表達細胞模型分別命名為BGC823-EBNA1及其對照BGC823-NC、SGC7901-EBNA1及其對照SGC7901-NC。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測EBNA1和E2F1 mRNA表達

采用TRIzol法提取細胞總RNA，使用First Strand cDNA合成試劑盒，將1 μg總RNA反轉錄為cDNA。使用FastStart Essential DNA Green Master對cDNA進行qRF-PCR。PCR反應體系20 μL，其內含有：Faststart Essential DNA Green Master Mix 10.0 μL，Forward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，RNase free water 8.0 μL，cDNA 1.0 μL。引物及其序列見表1。所有反應均在LightCycler96系統進行。采用2-△△Ct法分別計算EBNA1和E2F1基因相對表達量。△△Ct=△Ct 實驗組-△Ct 對照組，2-△△Ct表示實驗組目的基因相對于對照組表達差異的倍數。

1.5 Western blotting方法檢測EBNA1和E2F1蛋白表達

用含有體積分數0.10的苯甲磺酰氟（PMSF）和體積分數0.10的廣譜磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞總蛋白。將蛋白與5×的SDS-PAGELoading Buffer混合后沸水煮5 min。然后以每孔25 μg的上樣量進行SDS-PAGE凝膠電泳后轉至0.45 μm的PVDF膜上。用50 g/L的脫脂牛奶室溫封閉2 h后，應用TBST洗3次，一抗孵育4 ℃過夜。將孵育盒取出，一抗平衡室溫30 min后，應用TBST洗3次， 室溫二抗孵育2 h，以ECL化學發光法檢測。用Image J軟件進行蛋白灰度值分析，結果以目的蛋白灰度值/內參照蛋白灰度值表示。

1.6 統計學分析

應用GraphPad Prism 8軟件進行統計分析。計量資料結果以±s表示，數據間比較采用t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各種細胞EBNA1和E2F1表達比較

qRT-PCR和Western blotting檢測顯示，所有EBVaGC細胞均表達EBNA1，而EBVnGC細胞不表達;E2F1 mRNA在EBVaGC細胞的表達水平明顯高于EBVnGC細胞，差異有顯著性（t=13.60，Plt;0.01）;而E2F1蛋白在EBVaGC和EBVnGC細胞的表達水平差異無統計學意義（t=1.757，Pgt;0.05）。見圖1、表2。

2.2 EBNA1穩定表達細胞鑒定

Western blotting檢測結果顯示，EBNA1蛋白在BGC823-EBNA1和SGC7901-EBNA1細胞中穩定表達，而對照組細胞則不表達，證明EBNA1穩定表達的細胞模型已經成功建立。見圖2、表3。

2.3 EBNA1穩定表達細胞系中E2F1的表達情況

qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，BGC823-EBNA1組和SGC7901-EBNA1組E2F1的mRNA表達均上調，差異有顯著性（t=9.939、14.080，Plt;0.01）。Western blotting結果顯示，與對照組相比，BGC823-EBNA1組和SGC7901-EBNA1組E2F1蛋白表達明顯上調（t=6.222、4.681，Plt;0.05）。見圖3、表4。

3 討論

EBV是第一種被確定的人類腫瘤相關的病毒，在不同的腫瘤中具有不同的潛伏感染狀態并表達不同的潛伏期基因。普遍認為EBVaGC中EBV介于Ⅰ型和Ⅱ型潛伏之間[9]，其中確定表達的病毒潛伏基因包括EBNA1和EBERs，也有部分病例可能表達LMP1或LMP2A[10-11]。EBNA1是第一個被報道的EBV潛伏期蛋白，并在所有類型的潛伏細胞中都表達，對EBV基因組的穩定存在起著重要的作用[12]，并通過與病毒附加體中特定DNA序列的相互作用激活其他EBV潛伏基因的表達。EBNA1也可以與多種細胞蛋白相互作用進而調節細胞存活和腫瘤形成，提示EBNA1對EBV相關腫瘤發生發展具有重要作用。EBVaGC約占胃癌病例的10%，是所有EBV相關腫瘤中病人數量最多的疾病[13]。EBVaGC具有獨特的分子特征，例如較高的DNA超甲基化發生率、程序性死亡配體1（PD-L1）的過表達、PIK3CA和ARID1A突變顯著增加和免疫浸潤增加等[14]。多項研究表明，EBV感染的胃癌細胞中EBNA1表達為宿主細胞的存活、生長能力和轉化潛能提供了便利，包括逃避免疫監視、降低對DNA損傷的反應或通過抑制野生型P53蛋白表達降低凋亡應激刺激敏感性等[15]。但是，EBNA1在EBVaGC中發揮的作用及其機制還需進一步研究。

E2F轉錄因子是多種細胞事件的重要參與者，包括細胞周期、DNA合成、DNA修復和核轉錄等。E2F1是E2F家族中研究最多的成員，其通過調節編碼和非編碼轉錄物的表達在腫瘤發生發展中起著關鍵作用[16-17]。有趣的是，E2F1可以根據細胞環境不同作為癌基因或者抑癌基因來調節腫瘤的發生[18-19]。E2F1的激活是致癌病毒促進細胞增殖的常見策略，并且其在EBV中已經得到證實。

1991年，腺病毒E1A基因的產物被證明與視網膜母細胞瘤相關蛋白（Rb）相互作用[20]。此后研究也表明，Rb可與E2F轉錄因子家族成員結合[21]。在鑒定了所有不同形式的E2Fs后[22]，E2F1被認為是主要的Rb結合細胞蛋白[23]。E2F1蛋白的功能受視網膜母細胞瘤蛋白Rb的調節。當Rb為非高磷酸化形式時，它通過其口袋結構域與E2F1結合，并抑制E2F1的序列特異性DNA結合[24-25]。

在伯基特淋巴瘤中，在核糖體活性失調的情況下，EBNA1可通過激活E2F1來恢復核糖體的活性，而不依賴于pRb[25]。EBNA3C也可以在非Rb依賴性途徑中，通過募集E2F6到E2F1的啟動子來下調E2F1的表達，最終導致細胞增殖[26]。另外有研究結果證明，EBNA3C可促進S18-2與pRb的結合，提高游離E2F1水平[27]。有研究顯示，胃癌病人E2F1表達顯著增加，E2F1可促進細胞增殖及細胞周期進展，且其高表達與胃癌病理分期差、腫瘤變大及預后更差呈正相關[28]。基于以上研究，本文在EBVaGC細胞中進行了系列實驗探討EBNA1和E2F1在腫瘤發生發展中的作用。結果顯示，EBVaGC細胞中E2F1的mRNA表達較EBVnGC細胞增高，但蛋白表達水平差異無顯著性;與對照組相比，過表達EBNA1后E2F1的mRNA和蛋白表達均明顯上調。表明胃癌細胞中外源性EBNA1表達可促進E2F1的轉錄及翻譯，并可能通過影響E2F1表達誘導腫瘤形成。EBVaGC細胞和EBVnGC細胞中E2F1蛋白表達差異無顯著性，這可能是多種因素共同作用的結果，EBNA1對其表達的調控只是其中一個方面，具體的調控機制還有待進一步研究。

綜上所述，EBNA1可能通過上調E2F1的表達，從而促進EBVaGC的發生發展。闡明EBV介導的腫瘤生成的具體機制，有助于E2F1高表達胃癌病人的臨床治療，擴大治療效益。因此，EBNA1對E2F1表達調控的具體機制以及E2F1在胃癌中的生物學功能有進一步研究的意義。對EBV編碼EBNA1調控E2F1表達的研究可能為EBV相關腫瘤的靶向治療提供實驗依據。

[參考文獻]

[1]MANGANI D， ROBERTI A， RIZZOLIO F， et al. Emerging molecular networks in Burkitt’s lymphoma[J].Journal of Cellular Biochemistry， 2013，114（1）：35-38.

[2]YOUNG L S， RICKINSON A B. Epstein-Barr virus： 40 years on[J].Nature Reviews Cancer， 2004，4（10）：757-768.

[3]NISHIKAWA J， IIZASA H， YOSHIYAMA H， et al. Clinical importance of Epstein-Barr virus-associated gastric cancer[J].Cancers， 2018，10（6）：E167.

[4]KOVESDI I， REICHEL R， NEVINS J R. Identification of a cellular transcription factor involved in E1A trans-activation[J].Cell， 1986，45（2）：219-228.

[5]BAGCHI S， WEINMANN R， RAYCHAUDHURI P. The retinoblastoma protein copurifies with E2F-I， an E1A-regulated inhibitor of the transcription factor E2F[J].Cell， 1991，65（6）：1063-1072.

[6]LI Y H， HUANG J， YANG D J， et al. Expression patterns of E2F transcription factors and their potential prognostic roles in breast cancer[J].Oncology Letters， 2018，15（6）：9216-9230.

[7]LIANG Y X， LU J M， MO R J， et al. E2F1 promotes tumor cell invasion and migration through regulating CD147 in prostate cancer[J].International Journal of Oncology， 2016，48（4）：1650-1658.

[8]SUN C C， ZHOU Q， HU W， et al. Transcriptional E2F1/2/5/8 as potential targets and transcriptional E2F3/6/7 as new biomarkers for the prognosis of human lung carcinoma[J]. Aging， 2018，10（5）：973-987.

[9]YANG J， LIU Z F， ZENG B， et al. Epstein-Barr virus-asso-

ciated gastric cancer： a distinct subtype[J].Cancer Letters， 2020，495：191-199.

[10]LUO B， WANG Y， WANG X F， et al. Expression of Epstein-Barr virus genes in EBV-associated gastric carcinomas[J].World Journal of Gastroenterology， 2005，11（5）：629-633.

[11]SBIH-LAMMALI F， DJENNAOUI D， BELAOUI H， et al. Transcriptional expression of Epstein-Barr virus genes and proto-oncogenes in north African nasopharyngeal carcinoma[J].Journal of Medical Virology， 1996，49（1）：7-14.

[12]ALTMANN M， PICH D， RUISS R， et al. Transcriptional activation by EBV nuclear antigen 1 is essential for the expression of EBV’s transforming genes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2006，103（38）：14188-14193.

[13]PARKIN D M， BRAY F， FERLAY J， et al. Global cancer statistics， 2002[J].CA： a Cancer Journal for Clinicians， 2005，55（2）：74-108.

[14]CRISTESCU R， LEE J， NEBOZHYN M， et al. Molecular analysis of gastric cancer identifies subtypes associated with distinct clinical outcomes[J].Nature Medicine， 2015， 21（5）：449-456.

[15]CHENG T C， HSIEH S S， HSU W L， et al. Expression of Epstein-Barr nuclear antigen 1 in gastric carcinoma cells is associated with enhanced tumorigenicity and reduced cisplatin sensitivity[J].International Journal of Oncology， 2010，36（1）：151-160.

[16]SUN M， NIE F Q， WANG Y F， et al. LncRNA HOXA11-AS promotes proliferation and invasion of gastric cancer by scaffolding the chromatin modification factors PRC2， LSD1， and DNMT1[J].Cancer Research， 2016，76（21）：6299-6310.

[17]TARANGELO A， LO N， TENG R， et al. Recruitment of Pontin/Reptin by E2f1 amplifies E2f transcriptional response during cancer progression[J].Nature Communications， 2015，6：10028.

[18]ENGELMANN D， P TZER B M. The dark side of E2F1： in transit beyond apoptosis[J].Cancer Research， 2012，72（3）：571-575.

[19]YAMASAKI L， BRONSON R， WILLIAMS B O， et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1（+/-）mice[J].Nature Genetics， 1998，18（4）：360-364.

[20]KAELIN W G Jr， KREK W， SELLERS W R， et al. Expression cloning of a cDNA encoding a retinoblastoma-binding protein with E2F-like properties[J].Cell， 1992，70（2）：351-364.

[21]POLAGER S， GINSBERG D. E2F-at the crossroads of life and death[J].Trends in Cell Biology， 2008，18（11）：528-535.

[22]HAZAR-RETHINAM M， ENDO-MUNOZ L， GANNON O， et al. The role of the E2F transcription factor family in UV-induced apoptosis[J].International Journal of Molecular Sciences， 2011，12（12）：8947-8960.

[23]BANDARA L R， LA THANGUE N B. Adenovirus E1a prevents the retinoblastoma gene product from complexing with a cellular transcription factor[J].Nature， 1991，351（6326）：494-497.

[24]HELIN K， HARLOW E， FATTAEY A. Inhibition of E2F-1 transactivation by direct binding of the retinoblastoma protein[J].Molecular and Cellular Biology， 1993，13（10）：6501-6508.

[25]GNANASUNDRAM S V， PYNDIAH S， DASKALOGIANNI C， et al. PI3Kδ activates E2F1 synthesis in response to mRNA translation stress[J].Nature Communications， 2017，8（1）：2103.

[26]PEI Y G， BANERJEE S， SUN Z G， et al. EBV nuclear antigen 3C mediates regulation of E2F6 to inhibit E2F1 transcription and promote cell proliferation[J].PLoS Pathogens， 2016，12（8）： e1005844. doi：10.1371/journal.ppat.1005844.

[27]KASHUBA E， YURCHENKO M， YENAMANDRA S P， et al. EBV-encoded EBNA-6 binds and targets MRS18-2 to the nucleus， resulting in the disruption of pRb-E2F1 complexes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2008，105（14）：5489-5494.

[28]XU T P， WANG Y F， XIONG W L， et al. E2F1 induces TINCR transcriptional activity and accelerates gastric cancer progression via activation of TINCR/STAU1/CDKN2B signaling axis[J].Cell Death amp; Disease， 2017，8（6）： e2837. doi：10.1038/cddis.2017.205.

（本文編輯 黃建鄉）