GPSM1在結直腸癌中的表達及意義

[摘要] 目的 探討G蛋白信號調節蛋白1（GPSM1）在結直腸癌中的表達及意義。

方法 收集2015年4月—2016年4月青島大學附屬醫院收治的150例原發性結直腸癌病人的石蠟組織樣本及臨床病理資料。采用免疫組織化學法檢測GPSM1在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達，采用實時熒光定量PCR法檢測結直腸癌病人石蠟組織樣本中KRAS和NRAS的突變情況;分析GPSM1在結直腸癌組織中表達水平與病人臨床病理特征及預后的相關性。

結果 結直腸癌組織中GPSM1的表達水平明顯高于癌旁組織（χ2=102.938，P<0.001）。GPSM1在結直腸癌組織中的高表達與淋巴結轉移（χ2=5.429，P=0.020）及KRAS突變（χ2=4.030，P=0.045）相關。生存分析結果顯示，GPSM1高表達組結直腸癌病人的無病和總體生存期較GPSM1低表達組明顯縮短（P=0.046、0.036）。

結論 GPSM1在結直腸癌組織中高表達，并且與病人不良預后相關，可作為預測結直腸癌轉移的潛在生物學指標。

[關鍵詞] 結直腸腫瘤;GTP結合蛋白質調節劑;基因，ras;腫瘤轉移;預后

[中圖分類號] R735.34

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）06-0841-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.168

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210909.1512.002.html;2021-09-09 18：15：02

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF G-PROTEIN SIGNALING MODULATOR 1 IN COLORECTAL CANCER

CHEN Yang， RAN Wenwen， WANG Lu， SONG Yaolin， LI Guangqi， XING Xiaoming

（Department of Pathology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the expression and significance of G-protein signaling modulator 1 （GPSM1） in colorectal cancer （CRC）.

Methods Paraffin-embedded tumor specimens and clinicopathological data were collected from 150 patients with primary CRC who were admitted to The Affiliated Hospital of Qingdao University from April 2015 to April 2016. Immunohistochemistry was usedto measure the expression of GPSM1 in CRC tissue and adjacent tissue， and quantitative real-time PCR was used to measure KRAS and NRAS mutations in paraffin-embedded tumor specimens. The association of GPSM1 expression in CRC tissue with clinicopathological features and prognosis was analyzed.

Results The expression level of GPSM1 in CRC tissue was significantly higher than that in the corresponding adjacent tissue （χ2=102.938，Plt;0.001）. The high expression of GPSM1 in CRC tissue was significantly associated with lymph node metastasis （χ2=5.429，P=0.020） and KRAS mutation （χ2=4.030，P=0.045）. The survival analysis showed that compared with the low GPSM1 expression group， the high GPSM1 expression group had significantly shorter disease-free survival time and overall survival time （P=0.046，0.036）.

Conclusion GPSM is highly expressed in CRC tissue， which might be associated with the poor prognosis of CRC patients， and GPSM1 may be used as a potential biological marker for predicting the metastasis of CRC.

[KEY WORDS]colorectal neoplasms; GTP-binding protein regulators; genes， ras; neoplasm metastasis; prognosis

結直腸癌（CRC）是胃腸道常見的惡性腫瘤之一，是全球范圍內的第四大惡性腫瘤[1]。CRC起病隱匿，侵襲轉移能力強，晚期轉移是多數病人死亡的主要原因，但其轉移的分子機制目前尚不明確[2]。G蛋白信號調節蛋白1（GPSM1）為G蛋白信號激活蛋白家族Ⅱ（AGSⅡ）的成員，是1999年由英國科學家在對酵母進行遺傳學篩查時發現的一種蛋白質，該蛋白由N末端的7個四肽重復序列（TPR）和C末端的4個G蛋白調節模體（GPR）組成[3-4]。GPSM1在神經組織、睪丸組織中廣泛分布，作為鳥嘌呤核苷酸解離抑制劑參與G蛋白信號通路的調節，以及神經元分化和紡錘體形成等多種生物學進程[3-8]。近年來研究顯示，GPSM1在人食管鱗狀細胞癌、前列腺癌組織中異常表達并影響腫瘤細胞的增殖、轉移及凋亡[9-10]。GPSM1也參與CRC細胞系HT29巨自噬的早期調控[11]，但GPSM1在CRC中的表達及作用尚不明確。大鼠肉瘤病毒（RAS）

基因突變是癌癥最易發生的突變之一，約42%的CRC病人伴RAS基因突變[12]。RAS基因屬于原癌基因家族，編碼KRAS、NRAS和HRAS，其中KRAS突變率最高（約占85%）[13]。RAS基因突變可使細胞信號傳導異常激活，持續傳遞有絲分裂信號，誘導細胞增殖分化，促進腫瘤發生[14]。美國腫瘤聯合會（AJCC）第8版癌癥分期系統明確指出，KRAS和NRAS是影響CRC預后的關鍵因素[15]。本研究旨在通過檢測GPSM1在CRC組織中的表達，探討GPSM1表達與KRAS、NRAS突變及病人臨床病理特征的相關性，以期為CRC防治提供新的分子標志物及治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年4月—2016年4月青島大學附屬醫院收治的150例CRC病人的石蠟組織樣本及臨床病理資料，臨床病理資料包括病人性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移、KRAS和NRAS突變情況等。所有病人均為原發性CRC，術前未行放化療和靶向治療。對150例CRC病人定期進行電話和門診隨訪，隨訪截止日期為2020年3月。150例病人均有完整的隨訪資料，其中52例病人死亡，9例病人發生了術后轉移復發。本研究經青島大學附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織芯片制備 由兩名病理醫師對所有蠟塊進行復片，光學顯微鏡下選取典型區域并標記，使用Pathology Devices TMAjrTM組織芯片點樣儀制作孔徑為2.0 mm的組織芯片，4 μm切片。

1.2.2 GPSM1免疫組織化學檢測 采用PV-6000法進行免疫組織化學染色。組織芯片經脫蠟、水化后，使用體積分數0.03的過氧化氫滅活內源性過氧化物酶10 min，高壓修復2 min（枸櫞酸鹽pH值6.0）;滴加GPSM1一抗（1∶200，NBP1-91968，NOVUS，美國），以PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜;滴加通用型二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司），37 ℃孵育30 min;DAB顯色3 min，使用蘇木精復染，脫水、封片。

每張切片由兩名資深病理醫師隨機選擇5個高倍視野，判讀GPSM1染色結果。GPSM1陽性染色定位于細胞漿。根據染色強度及陽性細胞率進行半定量評分。染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;陽性細胞率評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51～75%為3分，>75%為4分。兩項評分相乘，≥4分為高表達，<4分為低表達[16]。

1.2.3 KRAS及NRAS基因突變的檢測 使用石蠟包埋組織DNA提取試劑盒（TIANGEN公司，DP331-02，中國）提取150例CRC石蠟組織切片中的DNA，然后應用KRAS、NRAS突變檢測試劑盒（上海源奇生物制藥有限公司）檢測其突變情況。使用ABI7500實時熒光定量PCR系統（Thermo Fisher Scientific Inc，美國）進行擴增。KRAS基因突變擴增程序為：42 ℃、5 min;94 ℃、3 min;94 ℃、15 s，60 ℃、60 s;共40個循環;于60 ℃下采集熒光信號。NRAS基因突變擴增程序為：42 ℃、 5 min;94 ℃、3 min;94 ℃、 45 s，60 ℃、80 s;共40個循環;于60 ℃下采集熒光信號。

1.3 統計學分析

使用SPSS 23.0軟件對數據進行統計學處理。GPSM1表達與KRAS、NRAS突變及臨床病理特征的關系分析采用Pearson χ2檢驗;GPSM1表達與病人術后生存時間的關系分析采用Kaplan-Meier生存分析和Log rank檢驗，生存曲線的繪制采用GraphPad Prism 7軟件。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 GPSM1在CRC組織中的表達

免疫組織化學檢測結果顯示，GPSM1在CRC組織細胞漿中呈高表達，在癌旁組織細胞漿呈低表達或不表達（圖1）。在CRC組織中，108例呈高表達，42例呈低表達;在癌旁組織中，21例呈高表達，129例呈低表達。GPSM1在CRC組織與癌旁組織中的表達差異具有統計學意義（χ2=102.938， P<0.001）。

2.2 KRAS及NRAS基因突變情況

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，CRC組織KRAS及NRAS突變率分別為44.00%（66/150）和3.33%（5/150）。

2.3 GPSM1表達水平與CRC病人臨床病理特征的關系

GPSM1在CRC組織中的高表達與淋巴結轉移（χ2=5.429，P=0.020）以及KRAS突變（χ2=4.030，P=0.045）相關，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、浸潤深度、遠處轉移、NRAS突變等均無相關性（P>0.05）。見表1。

2.4 GPSM1表達與CRC病人預后的關系

根據GPSM1在CRC組織中的表達水平將CRC病人分為GPSM1高表達和低表達組，Kaplan Meier生存分析顯示，GPSM1高表達組（n=108）CRC病人的無病和總體生存期較GPSM1低表達組（n=42）明顯縮短（P=0.046、0.036）。見圖2。

3 討論

GPSM1是調節G蛋白信號轉導系統的重要蛋白之一，生理狀態下其主要作用是介導G蛋白信號轉導通路的調控，參與神經元分化以及紡錘體形

成[3-5]。近年的研究發現，GPSM1在多種腫瘤組織

中異常表達，包括人食管鱗狀細胞癌、胃癌、前列腺癌等，并且與腫瘤惡性程度及細胞增殖和侵襲性相關[9-10，17]。但GPSM1在CRC組織中的表達及意義尚缺乏相關研究。本研究通過免疫組織化學染色檢測顯示，GPSM1在CRC組織中的表達水平較其在癌旁組織明顯升高，且是CRC病人預后不良的指標，提示GPSM1可能參與了CRC的發生發展。

目前研究表明，GPSM1與多種腫瘤的發生密切相關。SHI等[9]研究顯示，食管鱗狀細胞癌組織中GPSM1的低表達狀態與腫瘤的分級呈正相關，GPSM1高表達的病人生存時間更長，GPSM1是食管鱗狀細胞癌病人獨立的預后因素;并且過表達GPSM1能夠明顯抑制食管鱗狀細胞癌細胞的增殖。ZHANG等[17]研究證實，GPSM1的DNA甲基化可能參與胃癌的侵襲和轉移，并且與癌癥病人的預后顯著相關。ADEKOYA等[10]的研究結果表明，GPSM1在前列腺癌中表達水平明顯增高，前列腺癌細胞中過表達GPSM1可促進體內、體外腫瘤細胞的增殖。本研究對CRC組織中GPSM1表達與病人臨床病理特征的相關性進行分析，結果顯示，CRC組織高表達GPSM1的病人更容易發生淋巴結轉移，而GPSM1表達與病人年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分化程度等均無關。進一步分析GPSM1表達與CRC病人預后關系顯示，GPSM1高表達病人預后較差，提示GPSM1可能參與了CRC的侵襲轉移，是CRC預后不良的預測指標。

目前，GPSM1在CRC中作用的分子機制及相關信號轉導通路尚未闡明。研究表明，Notch信號通路參與了CRC的上皮間質轉化過程并調控腫瘤干細胞的形成，可促進CRC轉移以及腫瘤形成[18]。Wnt/β-catenin信號通路在腸隱窩底部激活、結直腸穩態維持及腫瘤形成過程中均發揮至關重要的作用[19]。另外，核因子κB（NF-κB）、表皮生長因子受體（EGFR）、RAS等信號通路在調控CRC細胞凋亡、增殖、轉移方面均發揮重要作用[20-22]。

KRAS突變是常見的致癌性突變，以12、13位密碼子突變最為多見。突變型KRAS能夠擺脫上游信號分子EGFR的調控，促進RAS-RAF-MEF-ERK信號通路的激活，增強腫瘤細胞對機體的適應性，促進腫瘤發生發展[23-24]。多項研究結果顯示，KRAS突變與CRC轉移顯著相關，是CRC轉移的潛在生物標志物[25-26]。本研究結果顯示，CRC組織中GPSM1表達水平與KRAS突變顯著相關。表明GPSM1可能與KRAS協同作用，促進CRC的發生與演進，或可作為臨床檢測CRC轉移的補充指標。KRAS突變可影響下游信號通路傳導，使腫瘤細胞對西妥昔單抗產生耐藥，且KRAS與GPSM1

均可調控鳥嘌呤核苷酸的水解與結合，二者在功能上具有相似性[27-29]。這提示GPSM1可能與KRAS一同在西妥昔單抗的耐藥機制中發揮作用，或可成為西妥昔單抗耐藥的潛在指標。

綜上所述，GPSM1在CRC中呈高表達狀態，與CRC病人淋巴結轉移及KRAS突變存在相關性，并與不良預后相關，可作為CRC診斷、治療及預后判斷的潛在指標。

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（本文編輯 馬偉平）