口腔鱗狀細胞癌RARRES2表達和中性粒細胞浸潤與預后關系

[摘要] 目的 探討口腔鱗狀細胞癌（OSCC）組織視黃酸受體反應蛋白（RARRES2）的表達及其與中性粒細胞浸潤密度的關系，并分析其與臨床病理特征及預后的關系。

方法 應用免疫組織化學方法，檢測74例OSCC組織標本及其對應的癌旁正常組織中RARRES2表達和中性粒細胞浸潤情況，Spearman相關分析RARRES2表達和中性粒細胞密度之間的關系，Transwell實驗檢測RARRES2對中性粒細胞趨化能力的影響。應用Mann-Whitney檢驗分析RARRES2表達和中性粒細胞密度與臨床病理因素的關系，Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗進行生存分析，Cox回歸模型分析影響OSCC生存的危險因素。

結果 免疫組織化學檢測結果顯示，OSCC組織RARRES2表達顯著高于癌旁組織（Z=-6.091，Plt;0.01），RARRES2高表達的OSCC組織區域中性粒細胞浸潤的密度高于RARRES2相對低表達的癌組織區域（U=433.5，Plt;0.05）。Transwell結果顯示，重組RAREES2對中性粒細胞樣細胞有明顯趨化作用。Spearman相關分析顯示，RARRES2的表達和中性粒細胞浸潤呈正相關（r=0.309，Plt;0.05）。Mann-Whitney分析顯示，OSCC組織RARRES2高表達且中性粒細胞高密度與淋巴結轉移（Z=-4.789，Plt;0.01）、TNM分期（Z=-4.293，Plt;0.01）和腫瘤復發（Z=-2.578，Plt;0.01）相關。生存分析顯示，RARRES2高表達且中性粒細胞高密度的OSCC病人術后總體生存時間和無病生存時間更短（P=0.001～0.017）。Cox多因素回歸分析表明，RARRES2高表達且中性粒細胞高密度是影響OSCC病人術后總體生存時間和無病生存時間的獨立預后因素（P=0.031、0.003）。

結論 RARRES2高表達且中性粒細胞高密度提示OSCC病人預后不良，二者可作為判斷OSCC病人預后的潛在指標。OSCC組織中RARRES2高表達可以趨化更多中性粒細胞浸潤。

[關鍵詞] 視黃酸受體反應蛋白;中性白細胞;頭頸部鱗狀細胞癌;預后

[中圖分類號] R365;R739.91

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）06-0831-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.200

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211230.1017.004.html;2021-12-30 14：22：45

CORRELATION BETWEEN RARRES2 EXPRESSION AND NEUTROPHIL INFILTRATION IN ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA AND THEIR RELATIONSHIP WITH PROGNOSIS

HU Xiaoyuan， FENG Yuanyong， YANG Qian， GAO Fei， WANG Ning， XIANG Fenggang

（Department of Pathology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]Objective＼To explore the correlation between the expression of retinoic acid receptor responder protein （RARRES2） and neutrophil infiltration density in oral squamous cell carcinoma （OSCC） tissue， and to analyze their relationship with the clinicopathological characteristics and prognosis.

Methods Immunohistochemical methods were used to determine RARRES2 expression and neutrophil infiltration in 74 OSCC tissue specimens and their corresponding normal paracancerous tissues， Spearman correlation analysis was used to assess the relationship between RARRES2 expression and neutrophil density， and Transwell assay was used to determine the effect of RARRES2 on the chemotaxis of neutrophils. Mann-Whitney test was used to analyze the relationship of RARRES2 expression and neutrophil density with clinicopathological factors， the Kaplan-Meier method and Log-rank test were used for survival analysis， and the Cox regression model was used to analyze the risk factors affecting OSCC survival.

Results The immunohistochemical assay showed that the RARRES2 expression in the OSCC tissues was significantly higher than that in the paracancerous tissues （Z=-6.091，Plt;0.01） and the neutrophil infiltration density in the OSCC tissues with high RARRES2 expression was higher than that in cancerous tissues with relatively low RARRES2 expression （U=433.5，Plt;0.05）. Transwell results showed that recombinant RAREES2 had a significant chemotactic effect on neutrophil-like cells. Spearman correlation analysis showed that RARRES2 expression was positively correlated with neutrophil infiltration （r=0.309，Plt;0.05）. Mann-Whitney analysis showed that high RARRES2 expression and high neutrophil density were correlated with lymph node metastasis （Z=-4.789，Plt;0.01）， TNM staging （Z=-4.293，Plt;0.01）， and tumor recurrence （Z=-2.578，Plt;0.01）.

The survival analysis showed that OSCC patients with high RARRES2 expression and high neutrophil density had significantlyshorter over-all survival time and disease-free survival time after surgery （P=0.001 to 0.017）; the Cox multivariate regression analysis showed that high RARRES2 expression and high neutrophil density were independent prognostic factors influencing the overall survival time and disease-free survival time of OSCC patients after surgery （P=0.031，0.003）.

Conclusion High RARRES2 expression and high neutrophil density indicate a poor prognosis of OSCC patients， both of which can be used as potential indicators for the prognosis of OSCC patients. High RARRES2 expression in the OSCC tissues can result in chemotaxis of increased neutrophil infiltration.

[KEY WORDS]retinoic acid receptor reactive protein; neutrophils; squamous cell carcinoma of head and neck; prognosis

頭頸部癌癥是全球第八大常見癌癥，該病病人的5年生存率為50%～60%[1-2]。口腔鱗狀細胞癌（OSCC）是頭頸部較常見的惡性腫瘤之一，其發生和發展的確切分子機制尚不明確。尋找影響其發生、發展及預后的腫瘤標志物對OSCC靶向治療及預后有重要意義。腫瘤微環境中除包含癌細胞外，還包括免疫系統的細胞如中性粒細胞、巨噬細胞等[3]。最近的研究表明，中性粒細胞作為腫瘤微環境中的一個關鍵因子，在腫瘤的進展過程中起重要的調節作用[4]。視黃酸受體反應蛋白（RARRES2）也稱為chemerin，是趨化因子樣受體CMKLR1的配體[5]。RARRES2可以通過招募表達CMKLR1的免疫細胞趨化到淋巴器官和組織損傷部位，從而在免疫反應中起重要作用[5-7]，因此RARRES2可能在腫瘤免疫監視中起重要作用。WEIGERT等[8]研究發現，腸道炎癥病人血清中的RARRES2水平較健康對照組高，RARRES2在腸道炎癥中具有潛在的調節功能。還有研究顯示，RARRES2是非小細胞肺癌（NCLC）的生物標志物，它在肺癌相關慢性炎癥到癌變過程中起著關鍵作用[9]。既往研究表明，RARRES2在OSCC高表達[10]，OSCC組織中性粒細胞浸潤增加[11]，這兩個因素都與OSCC病人臨床預后不良有關[10-11]。然而，關于RARRES2對腫瘤中性粒細胞浸潤影響的報道較少。本研究檢測OSCC組織中RARRES2的表達水平和中性粒細胞浸潤的密度，探討二者與OSCC病人臨床病理特征及生存預后的關系。

1 材料與方法

1.1 標本收集

收集青島大學附屬醫院口腔頜面外科2005—2010年手術切除的74例OSCC癌組織及其對應的癌旁相對正常組織標本。病人男51例，女23例，年齡32～86歲，平均（60.4±11.1）歲。所有病人均未接受化療、放療等抗腫瘤治療。所有手術切除標本經40 g/L甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，用于免疫組織化學檢測。由兩位經驗豐富的病理醫師確診為OSCC。所有病人臨床病理資料完整。該研究得到了青島大學附屬醫院倫理委員會的批準，并且符合赫爾辛基宣言要求。

1.2 主要試劑

人早幼粒血細胞（HL-60細胞）購于中國科學院。RPMI-1640 培養基和胎牛血清（Gibco公司）;重組人RARRES2抗體、RARRES2抗體（Abcam公司，美國）;全反式視黃酸（Sigma公司，美國）;CD15陽性抗體、Polymer免疫組織化學雙染檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 免疫組織化學雙染色及結果判定

全部組織標本石蠟包埋，55 ℃陣列融合，4 μm厚連續切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，復檢。使用Po-lymer雙染檢測試劑盒進行染色：組織切片經脫蠟和梯度乙醇水化后，加體積分數0.03的H 2O 2滅活內源酶;在95 ℃ EDTA緩沖液中加熱修復抗原，自然冷卻，水洗，加入RARRES2、CD15陽性混合一抗4 ℃孵育過夜;磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，加入二抗山羊抗兔抗體 37 ℃孵育30 min;PBS 沖洗后進行DAB 顯色和GBI顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。 由兩位經驗豐富的病理醫師在光鏡下雙盲閱片并判定結果。

免疫組織化學結果判定參照相關文獻標準[11]：在400倍光鏡下觀察，細胞質染色呈紅色或粉紅色為RARRES2陽性表達，中性粒細胞CD15陽性染色呈棕黃色或棕褐色。①RARRES2染色強度評分：0分，無著色（-）;1分，輕度染色（+）;2分，中度染色（）;3分，重度染色（）。陽性細胞占比計分：0分（lt;5%），1分（5%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（gt;75%）。免疫組織化學染色總分=染色強度得分+陽性細胞占比得分，總分lt;4分為低表達，≥4分為高表達。②CD15陽性中性粒細胞密度計算：在標本組織區域（直徑1 mm）中計數血管外CD15陽性中性粒細胞的數量，重復3次，計算每例標本的中性粒細胞數量平均值，最后算出74例OSCC組織的中性粒細胞數量的中位數。如果標本的平均數大于中位數，則為中性粒細胞高密度，否則為低密度。根據RARRES2表達和CD15陽性中性粒細胞密度，將組織標本分為3組：RARRES2低表達且CD15陽性中性粒細胞低密度組（#1），RARRES2低表達且CD15陽性中性粒細胞高密度組或RARRES2高表達且CD15陽性中性粒細胞低密度組（#2），RARRES2高表達且CD15陽性中性粒細胞高密度組（#3）。

1.4 中性粒細胞樣細胞（dHL-60細胞）的培養以及分化

HL-60細胞用含體積分數0.10胎牛血清高糖RPMI-1640培養基，置37 ℃、含體積分數0.05 CO 2 的細胞培養箱培養，應用1 μmol/ L全反式視黃酸誘導3 d，使HL-60細胞分化為dHL-60細胞。

1.5 Transwell實驗檢測細胞的趨化能力

將2×105個dHL-60細胞懸液接種在Transwell小室上室，以200 μL無血清培養基培養，下室為含有體積分數0.15胎牛血清和不同濃度重組人RARRES2（20、50、100 μg/L）的培養基600 μL，對照組下室為含有體積分數0.15胎牛血清的培養基。37 ℃孵育10 h后，使用細胞計數板對下室中的dHL-60細胞進行計數，計算趨化指數。趨化指數=實驗組的dHL-60細胞數/對照組的dHL-60細胞數×100%。

1.6 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數和百分比表示，數據間比較采用Wilcoxon秩和檢驗和Mann-Whitney檢驗。應用Spear-man相關分析RARRES2表達和CD15陽性中性粒細胞密度之間的關系，Mann-Whitney檢驗分析RARRES2表達和CD15陽性中性粒細胞密度與臨床病理因素的關系，Kaplan-Meier 法和Log-rank檢驗分析病人的生存時間和生存率，Cox回歸模型分析影響生存的危險因素。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OSCC組織CD15陽性中性粒細胞浸潤密度和RARRES2表達與臨床病理參數的關系

免疫組織化學雙染檢測顯示，OSCC組織中RARRES2高表達49例（66.22%），RARRES2低表達25例（33.78%）;而癌旁正常組織中RARRES2高表達10例（13.51%），RARRES2低表達64例（86.49%）。在所有OSCC組織和癌旁正常組織樣本中，血管外CD15陽性中性粒細胞的數量為1～968個，中位數為59.5;OSCC組織中高密度組38例（51.35%），低密度組36例（48.65%）;癌旁正常組織中高密度組11例（14.86%），低密度組63例（85.14%）。OSCC組織RARRES2表達顯著高于癌旁組織（Z=-6.091，Plt;0.01）;RARRES2高表達的OSCC組織區域CD15陽性中性粒細胞浸潤密度高于RARRES2相對低表達的癌組織區域（U=433.5，Plt;0.05）;OSCC組織RARRES2高表達且CD15陽性中性粒細胞高密度與淋巴結轉移（Z=-4.789，Plt;0.01）、TNM分期（Z=-4.293，Plt;0.01）和腫瘤復發（Z=-2.578，Plt;0.01）相關。Spearman相關分析表明，RARRES2表達與CD15陽性中性粒細胞的浸潤呈正相關（r=0.309，Plt;0.05）。見圖1和表1、2。

2.2 RARRES2表達和CD15陽性中性粒細胞浸潤與OSCC病人術后生存的關系

Kaplan-Meier分析表明，#1組、#2組、#3組平均總體生存時間分別為83.30、77.82和58.40個月，平均無病生存時間分別為83.30、76.38和46.66個月，#3組的總體和無病生存時間短于#1組、#2組（P=0.001～0.017），#2組的總體和無病生存時間與#1組相比較差異無統計學意義（P=0.474、0.382）。在TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期病人中，#1組、#2組、#3組平均總體生存時間分別為73.12、66.50和54.65個月，平均無病生存時間分別為76.12、50.60和20.25個月，#3組的平均無病生存時間較#1組、#2組短（P=0.045、0.048），#2組的總體和無病生存時間與#1組相比較差異無顯著意義（P=0.135）。見圖2。

2.3 OSCC病人的獨立預后因素

Cox模型單因素分析結果顯示，影響OSCC病人總體和無病生存時間的因素有臨床分期（P=0.007、0.002）、RARRES2表達水平和CD15陽性中性粒細胞密度（表達和密度）（P=0.004、0.002）、淋巴結轉移（P=0.012、0.003）。將單因素分析顯示對生存預后有影響的因素納入多因素分析，結果顯示，RARRES2表達水平和CD15陽性中性粒細胞密度（P=0.031、0.003）是影響OSCC病人總體和無病生存時間的獨立預后因素。見表3、4。

2.4 RARRES2對dHL-60細胞趨化的影響

Transwell實驗結果顯示，0、20、50、100 μg/L RARRES2各組趨化指數分別為1.03、2.52、4.02、5.59，表明RARRES2可以濃度依賴性地趨化dHL-60細胞，差異具有統計學意義（F=335.994，Plt;0.001）。

3 討論

中性粒細胞參與機體的固有免疫應答，為人體的第一道免疫防線。越來越多的證據表明，腫瘤相關的中性粒細胞（TANs）在腫瘤微環境中發揮重要作用，可通過合成和分泌相關細胞因子促進腫瘤的發生、發展和轉移[12]。RARRES2是一種新型的多功能脂肪因子，它在調節炎癥、脂肪代謝、血管生成、細胞增殖遷移和趨化作用中起著重要作用[13-16]。大量研究表明，RARRES2與腫瘤的發生發展有關，并可以用作腫瘤診斷的生物標志物[17]。ERDOGAN等[18]研究顯示，結直腸癌病人的RARRES2表達明顯高于健康對照組，認為其可作為結直腸癌診斷和預后生物標志物。WANG等[19]研究顯示，高水平的循環RARRES2與胃癌侵襲性增加有關。然而，關于腫瘤中RARRES2的表達與中性粒細胞浸潤關系的研究報道較少。

本研究探討OSCC組織中RARRES2表達和中性粒細胞浸潤的相關性，并分析其與臨床病理特征及預后的關系。結果顯示，RARRES2高表達區域中性粒細胞浸潤增多，RARRES2表達與CD15陽性中性粒細胞密度呈正相關。提示OSCC組織RARRES2高表達可能與中性粒細胞的浸潤有關。為了探討OSCC組織中RARRES2表達對中性粒細胞浸潤影響機制，本研究應用Transwell小室和HL-60細胞檢測了RARRES2對中性粒細胞的趨化作用。由于人中性粒細胞的壽命較短，很難在體外培養這些細胞。為了建立穩定可靠的細胞模型，本研究選擇了HL-60細胞株。該細胞系已被確定為研究炎癥和癌癥中性粒細胞活性和調節的模型[20-22]。本文結果顯示，重組RARRES2可以濃度依賴性地趨化dHL-60細胞。有研究表明，極化的中性粒細胞還可以通過產生促血管生成分子堿性成纖維細胞生長因子2來促進小鼠胃腸道癌肝轉移模型中的血管生成和肝轉移性腫瘤生長[23-24]。本研究結果還顯示，OSCC組織RARRES2高表達且CD15陽性中性粒細胞高密度與淋巴結轉移、TNM分期和腫瘤復發有關，而與性別、年齡、病理分級、腫瘤大小無關，說明在淋巴結轉移、TNM分期高和腫瘤復發的病人中RARRES2的表達水平更高、中性粒細胞浸潤更多。提示RARRES2高表達且CD15陽性中性粒細胞高密度可能與OSCC的進展密切相關。本研究Kaplan-Meier分析顯示，RARRES2高表達且CD15陽性中性粒細胞高密度OSCC病人的術后生存時間更短。此外，在TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期的OSCC病人中，RARRES2高表達且CD15陽性中性粒細胞高密度組的無病生存時間更短;Cox多因素回歸分析顯示，RARRES2高表達且CD15陽性中性粒細胞高密度是影響OSCC病人術后總體生存時間和無病生存時間的獨立預后因素。以上結果表明，RARRES2高表達且CD15陽性中性粒細胞高密度與OSCC病人預后差密切相關，RARRES2高表達且CD15陽性中性粒細胞高密度可能成為評價OSCC預后不良的一種有效指標。

綜上所述，OSCC組織中RARRES2高表達且CD15陽性中性粒細胞高密度均與OSCC病人不良的臨床預后有關。RARRES2可能通過吸引更多的CD15陽性中性粒細胞到達OSCC腫瘤部位來促進OSCC的演進和發展。

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（本文編輯 黃建鄉）