抗人紅細胞/抗豬瘟病毒雙功能單鏈抗體的制備及功能鑒定

劉金鳳，覃紹敏，石勝，林俊，杜毅超，馬玲，秦樹英，白安斌，陳鳳蓮，張振江，吳健敏*

(1.廣西壯族自治區獸醫研究所/廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001;2.上海海利生物技術股份有限公司，上海 201403)

豬瘟(classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一種急性、熱性及高度接觸性傳染病，是目前危害養豬業發展主要傳染病之一[1]。早在上世紀60年代，我國就成功研制了豬瘟兔化弱毒苗，對豬瘟急性發生和大規模流行控制起了決定性作用。然而，近年來豬瘟流行趨勢發生了變化，發病特征和臨床癥狀越來越復雜，出現典型豬瘟和非典型豬瘟并存，持續性感染和隱性感染共現的現象，豬瘟防控依然面臨著重要挑戰[2-4]。目前，除研制有效的豬瘟疫苗和制備抗豬瘟病毒特異性抗體外，開發經濟簡便的豬瘟病毒快速檢測方法，對有效進行豬瘟防控同樣具有重要意義。

紅細胞凝集試驗是一種以紅細胞作為指示物的免疫檢測技術，其主要試劑為紅細胞特異性抗體。紅細胞膜H抗原是一種共有抗原，分布在人所有血型紅細胞表面，以其為抗原制備的特異性抗體能與不同血型的紅細胞結合，不發生凝集反應，而當這種抗體與另外的抗原或抗體結合形成雙功能分子時，能通過待檢樣品中抗原或抗體的橋聯作用，使紅細胞發生肉眼可見的凝集反應[5-7]。單鏈抗體具有天然抗體的親和力，分子量小，易于改造并可大量制備，是構建雙功能抗體的理想元件[8-9]。本研究在抗人紅細胞膜H抗原單鏈抗體基因(2E8-scFv)[6]及抗豬瘟病毒單鏈抗體基因(CSFV-scFv)基礎上[10]，通過基因重組技術，以柔性肽(G4S)3連接，構建抗人紅細胞表面H抗原單鏈抗體與抗豬瘟病毒單鏈抗體融合的雙功能單鏈抗體基因，經大腸桿菌密碼子優化后進行原核表達，分析其雙功能活性，制備抗豬瘟病毒雙功能抗體，為進一步建立以紅細胞凝集試驗為技術支撐的CSFV病原快速檢測方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

TOP10感受態細胞、pCzn1質粒、BL21(Plyss)感受態細胞、CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2型(PCV2)、豬細小病毒(PPV)流行株均由本實驗室保存；CSFV、偽狂犬病毒(PRV)、PCV2、PRRSV、PPV病原陽性血清均為臨床病原檢測為單一病毒感染的豬血清；限制性內切酶、DNA Marker、T4連接酶為TaKaRa公司產品；質粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、蛋白Marker、BCA蛋白定量試劑盒為TIANGEN公司產品；IPTG為Promega公司產品；抗His單克隆抗體為 Invitrogen 公司產品；HRP-羊抗鼠IgG、FITC-羊抗鼠IgG為Solarbio公司產品；Ni-IDA親和層析柱為Novagen公司產品；其他化學試劑均為進口或國產分析純。

1.2 雙功能單鏈抗體基因密碼子優化及合成

將CSFV-scFv與2E8-ScFv通過彈性連接肽Linker(Gly4Ser)3連接，構建雙功能單鏈抗體基因2E8-CSFV，根據http://www.kazusa.or.jp/codon、GenScript Rare Codon Analysis Tool和CodonW1.4.2對2E8-CSFV基因序列密碼子組成、使用頻率及鳥嘌呤和胞嘧啶比率(GC含量)等進行分析，并根據大腸桿菌密碼子的偏好性[11]，利用密碼子優化軟件，將2E8-CSFV基因的部分密碼子替換成高度表達的大腸桿菌密碼子。優化后的雙功能單鏈抗體基因DNA序列發生變化，但表達的蛋白質氨基酸序列不變，并在基因的上游加入NdeⅠ，下游加入XbaⅠ酶切位點。優化后的雙功能單鏈基因由南京鐘鼎生物科技有限公司合成，連接于pUC載體，即 pUC-2E8CSFV。

1.3 雙功能單鏈抗體基因表達載體的構建

將重組質粒pUC-2E8CSFV和pCzn1載體分別用NdeⅠ、XbaⅠ雙酶切后凝膠電泳回收酶切產物，并進行T4 DNA連接，轉化TOP10感受態細胞，挑取單克隆，提取質粒并用NdeⅠ和XbaⅠ進行雙酶切鑒定后測序分析，構建重組質粒pCzn1-2E8CSFV。

1.4 重組質粒的原核表達

將測序正確的重組質粒pCzn1-2E8CSFV轉化BL21(Plyss)感受態細胞，挑取單菌落接種于3 mL 含Amp 的LB培養基中，37 ℃ 220 r/min 培養過夜，第2天按1∶100將菌液接種于30 mL 含Amp 的LB培養基中，培養至菌體OD600約0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，誘導培養4 h后取樣。同時以未經誘導的菌液為對照，細菌經超聲波破碎后進行離心，收集上清和沉淀經SDS-PAGE鑒定。

1.5 表達產物的純化

按1.4中的步驟方法對重組質粒進行誘導表達，表達培養體積為1 000 mL。離心棄上清收集菌體，將菌體重懸于20 mL 裂解液中，超聲波破碎后，4 ℃、10 000 r/mim 離心 20 min，收集包涵體沉淀，用包涵體洗滌液洗滌3次后，用溶解緩沖液按一定比例4 ℃放置過夜溶解包涵體，再次4 ℃、10 000 r/mim 離心 20 min，取上清經0.45 μm濾器過濾后，用Ni-IDA親和層析柱進行蛋白純化。收集洗脫液SDS-PAGE 檢測，并將其裝入透析袋中，用含有不同濃度(6、4、2、0 mol/L)尿素的復性液梯度稀釋復性，最后 PBS脫鹽，獲得純化蛋白-20 ℃保存備用。

1.6 單鏈抗體的活性鑒定

1.6.1 間接免疫熒光(IFA)檢測雙功能單鏈抗體病毒結合活性

用豬瘟病毒接種生長良好的PK-15細胞，37 ℃共培養24～72 h，細胞融合達80%時，以80%預冷丙酮固定細胞15～30 min，PBS洗滌2次后，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加入純化的重組蛋白37 ℃孵育1 h，PBS洗滌2次，加入抗His單克隆抗體37 ℃孵育1 h，加入FITC標記的羊抗鼠IgG，37 ℃ 避光孵育1 h，于熒光顯微鏡下觀察結果。同時以正常培養PK-15細胞，PPV和PCV2感染的PK-15細胞以及PRRSV感染的Marc-145細胞對照。

1.6.2 間接ELISA檢測雙功能單鏈抗體活性

收集CSFV細胞培養液，經反復凍融后，4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min，收集上清液制備病毒液。將病毒液4 ℃包被酶標板過夜(5 μg /mL)，PBST洗滌3次，加入3%脫脂奶粉封閉2 h，PBST洗滌3次。將表達的重組蛋白進行倍比稀釋，取100 μL分別加入各酶標孔，37 ℃結合反應1 h，PBST洗滌3次，加入100 μL/孔鼠抗His抗體(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，棄液體，PBST洗滌3次，加入100 μL/孔HRP標記的羊抗鼠二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，棄液體，PBST洗滌3次，加入100 μL/孔TMB顯色液，37 ℃顯色30 min后，加入2 mol/L H2SO4終止顯色，50 μL/孔，在450 nm 處讀取OD值。

1.6.3 紅細胞凝集試驗檢測雙功能單鏈抗體活性

取CSFV病原陽性、陰性血清，按50 μL/孔依次加入血凝板中，然后再每孔加入50 μL表達的重組蛋白(500 μg/mL)和50 μL 1%的O型(A、B、AB型)人紅血球細胞，混均勻，室溫靜置30～60 min，觀察結果，紅細胞呈網狀平鋪于孔底為100%凝集(++++)，紅細胞呈網狀平鋪于孔底，但邊緣下滑為75%凝集(+++)，紅細胞于孔底呈環狀或小團為50%凝集(++)，紅細胞少量凝集成小團為25%凝集(+)，紅細胞沉于孔底呈點狀為不凝集(-)。同時設置其他常見豬病毒PRV、PCV2、PRRSV、PPV經病原為陽性的血清作為對照。

2 結果

2.1 雙功能單鏈抗體基因設計優化及合成

CSFV-scFv和2E8-ScFv通過連接肽Linker(Gly4Ser)3連接，構建融合基因2E8-CSFV，綜合分析大腸桿菌密碼子偏好性、轉錄調節元件、mRNA二級結構、GC含量等參數，在不改變融合基因氨基酸序列的前提下，將基因所有密碼子替換成大腸桿菌使用頻率最高或次高的密碼子，優化后基因全長1 533 bp，GC含量為53.44%，處于相對平衡狀態，優化后合成基因連接于PUC，構建重組質粒pUC-2E8-CSFV。

2.2 雙功能單鏈抗體基因重組表達載體構建

將重組質粒pUC-2E8-CSFV酶切，回收目的片段后，定向克隆到pCzn1載體中，構建重組表達載體pCzn1-2E8-CSFV，重組質粒經酶切鑒定，可見預期長約4.4 kb目的條帶和1.5 kb的目的條帶(圖1)，將酶切鑒定正確的重組質粒進行測序鑒定，結果顯示與預期一致。

M.DL 5000 DNA Marker；1.pCzn1-2E8-CSFV質粒；2.pCzn1-2E8-CSFV雙酶切產物圖1 pCzn1-2E8-CSFV質粒酶切鑒定

2.3 雙功能單鏈抗體的原核表達

重組表達載體pCzn1-2E8-CSFV轉化大腸桿菌BL21(Plyss)，進行IPTG誘導表達，表達產物經SDS-PAGE分析，結果見圖2。在約55 kDa處出現明顯的誘導條帶，與預期結果相符合。進一步收集誘導菌液的上清及沉淀SDS-PAGE分析可知，目的蛋白主要以包涵體形式表達，主要存在于沉淀中(圖2)。

M.預染蛋白分子質量標準；1.未誘導的pCzn1-2E8-CSFV；2.IPTG誘導的pCzn1-2E8-CSFV；3.誘導破碎后上清；4.誘導破碎后沉淀圖2 pCzn1-2E8-CSFV表達產物SDS-PAGE分析

2.4 雙功能單鏈抗體的純化及鑒定

表達菌大量誘導表達，收集菌體制備包涵體，用Ni-IDA -Sepharose CL-6B 親和層析柱純化目的蛋白，并進行6 mol/L尿素變性和梯度復性，純化復性后目的蛋白經SDS-PAGE分析，結果見圖3。目的蛋白在大腸桿菌中高效表達，經親和層析柱純化后得到純度90%以上的純化蛋白，BCA測定蛋白濃度最高可達0.25 mg/mL。

M.蛋白分子質量標準；1.破碎后沉淀；2.流出液圖3 表達產物純化后SDS-PAGE分析

2.5 間接免疫熒光檢測雙功能單鏈抗體病毒結合活性

采用IFA方法檢測雙功能單鏈抗體病毒結合活性，結果見圖3。在熒光顯微鏡下可見CSFV病毒感染的細胞產生特異性綠色熒光(圖4)，而PRRSV、PCV2、PPV病毒感染組及陰性對照組細胞則無特異性熒光反應(圖略)，表明原核表達的重組雙功能單鏈抗體與豬瘟病毒具有良好的結合特性。

A.未感染CSFV的PK-15細胞；B.感染CSFV的PK-15細胞圖4 雙功能抗體間接免疫熒光檢測

2.6 間接ELISA檢測雙功能單鏈抗體活性

采用間接ELISA方法檢測雙功能單鏈抗體活性。以豬瘟病毒為抗原包被ELISA板，與不同濃度的重組蛋白2E8-CSFV進行反應，結果見圖5。2E8-CSFV濃度從0.5 mg/mL倍比稀釋后，隨著濃度降低，OD450值下降，表明原核表達的重組雙功能單鏈抗體2E8-CSFV具有較好的生物活性，與豬瘟病毒有一定的結合能力。

圖5 雙功能抗體與CSFV的結合活性分析

2.7 紅細胞凝集試驗檢測雙功能單鏈抗體活性

以不同血型的人紅細胞為指示劑，用純化復性后的重組雙功能單鏈抗體與不同豬病毒病原陽性血清進行紅細胞凝集試驗，結果見圖6。在不同血型(O、A、B、AB)紅細胞中，重組雙功能單鏈抗體2E8-CSFV 均能與CSFV病原為陽性的血清發生凝集反應，但與PRV、PCV2、PRRSV、PPV病原為陽性血清均未發生凝集反應(圖7)。表明原核表達的雙功能單鏈抗體2E8-CSFV既能與人紅細胞特異性結合，同時又能與豬瘟病毒反應，具有雙功能特性。

1.O型人紅細胞；2.A型人紅細胞；3.B型人紅細胞；4.AB型人紅細胞；A.雙功能單鏈抗體組；B.陰性對照組圖6 雙功能單鏈抗體紅細胞凝集特性檢測

1.PRV；2:PCV2；3.PPV；4.PRRSV；5.CSFV圖7 紅細胞凝集試驗方法特異性分析

3 討論

目前以scFv為基礎構建的雙功能抗體已在許多領域得到了廣泛應用并且具有多克隆抗體和單鏈抗體無法比擬的優點[12]，然而在動物醫學領域，對動物源性抗原單鏈抗體的研究相對匱乏，而豬瘟病毒單鏈抗體應用于豬瘟病原檢測國內更是鮮有報道。我國是養豬大國，每年因豬瘟造成的損失難以估計，豬瘟仍是限制我國養豬業發展的一大難題，防治任務艱巨，如何準確快速的進行豬瘟病原學診斷具有重要意義。盡管近年來PCR、DNA探針、ELISA等技術廣泛用于豬瘟病原的診斷研究，加快了病原微生物檢驗速度，有著不可替代的優勢[13]，然而，就我國養殖國情，基層獸醫站和養殖場并不具備開展這些技術的人員設備條件，難以開展大規模應用。因此，有必要探索一種簡便、快速、特異并適合基層生產使用的診斷技術。將單鏈抗體技術與以抗原抗體反應為本質的紅細胞凝集試驗技術相結合研制豬瘟病原快速診斷方法有望取得較好的應用前景。

獲得特異性強、活性高的雙功能抗體是建立紅細胞凝集試驗檢測方法的前提?；蛑亟M技術彌補了傳統化學交聯法和雙雜交瘤法操作復雜、穩定性差、產量低等缺點，可廣泛用于雙功能抗體的制備。1994年，Lilley等[14]首次應用基因重組技術制備出抗人紅細胞單鏈抗體和HIV-1抗原融合的雙功能抗體；邵長利等[6]以抗人紅細胞H抗原單克隆抗體為材料，制備其單鏈抗體2E8-scFv，并構建2E8-scFv融合HIV-1 gp41抗原肽的雙功能抗體，用于HIV抗體檢測，為建立基于紅細胞H抗原的免疫檢測技術奠定了基礎。我們實驗室在前期研究中以2E8-scFv為基礎，成功制備了用于豬瘟抗體[15]、偽狂犬抗體[16]及狂犬抗體[17]快速檢測的雙功能分子，進一步證實了2E8-scFv融合外源基因能在原核系統中表達，并具有雙功能活性。

本試驗應用基因重組技術，通過柔性肽將2E8-scFv和CSFV-scFv連接構建雙功能單鏈抗體基因。不同物種細胞在蛋白翻譯過程中，與外源基因所編碼的氨基酸密碼子使用頻率之間存在差異，研究表明密碼子優化能顯著提高蛋白的表達水平。為提高雙特異性抗體的表達效率，在不改變基因氨基酸序列前提下，綜合分析宿主細胞密碼子偏好性、mRNA二級機構、GC含量等參數對基因密碼子進行優化并合成，克隆至pCzn1原核載體進行大腸桿菌誘導表達。SDS-PAGE和Western blot鑒定目的蛋白主要以包涵體形式表達，其原因可能是大腸桿菌表達率過高，合成的蛋白沒有足夠的空間折疊，二硫鍵產生錯配或過多的蛋白非特異性結合，溶解度下降形成不溶性包涵體[18]。包涵體含量高、純度高，可作為活性蛋白貯存庫存在。通常采用氧化還原法或尿素梯度透析法從包涵體中獲得活性蛋白[19]，雙功能抗體半胱氨酸含量低，氧化還原半胱氨酸形成正確二硫鍵的方法，不適用于雙功能抗體的變性復性。因此本研究選用0 mol/L～6 mol/L尿素，對表達的包涵體進行變性和梯度透析，緩慢恢復線性多肽的正確結構。間接免疫熒光顯示復性后，雙功能抗體能與豬瘟病毒結合，保留了親本抗體的抗原結合活性，但試驗所用抗體濃度較高，可能與抗體純化復性方法有關，蛋白復性不完全，復性產物中活性蛋白含量低，導致抗體親和力低；此外，以CSFV為包被抗原，間接ELISA檢測雙功能抗體的CSFV結合活性，結果線性關系不理想，這可能與純化后的蛋白純度有關；進一步紅細胞凝集試驗表明，重組雙功能抗體能與CSFV抗原為陽性的血清發生凝集反應，證實雙功能抗體的雙特異性，但紅細胞凝集效果不太理想，抗體使用量較大，反應時間較長，與預期存在一定差距，雙功能抗體的活性、純度及凝集試驗的反應條件還需進一步優化提高。

綜上所述，本研究通過基因重組技術，成功構建密碼子優化型抗人紅細胞表面抗原與抗豬瘟病毒單鏈抗體融合的雙功能抗體基因，及其高效原核表達系統，成功制備出既能與人紅細胞結合，又能與CSFV病原反應的雙功能抗體，為后續建立CSFV病原紅細胞凝集試驗快速檢測方法奠定基礎。