2019年湖南省部分地區雞、鴨、豬源大腸桿菌耐藥性調查

唐標，陳怡飛，陳聰，王靜鴿，黃磊，錢鳴蓉，楊華*

(1.浙江省農業科學院農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，浙江 杭州 310021；2.浙江省農業科學院農產品質量安全與營養研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江理工大學生命科學與醫藥學院，浙江 杭州 310018；4.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016)

大腸埃希菌俗稱大腸桿菌，歸屬于腸桿菌科埃希菌屬(Escherichia)[1-2]。大腸桿菌在自然界中廣泛存在，是人畜腸道共棲菌和條件致病菌[3-4]，給畜禽養殖業造成嚴重的經濟損失。近年來，隨著抗生素在畜禽養殖中大量使用，導致了大腸桿菌的耐藥譜較廣且耐藥率居高不下[5-6]。對我國江蘇[7]、山東[8]、廣東[9]、浙江[10]、四川[11]、黑龍江[12]等地區動物源大腸桿菌的調查發現，大腸桿菌耐藥水平持續處于高位，多重耐藥性問題日益凸顯。多重耐藥大腸桿菌不僅威脅畜禽健康，也可進入環境或通過食物鏈對人類健康構成威脅。

湖南省是我國的農業大省，也是畜禽養殖大省。為調查湖南省部分地區動物源大腸桿菌的耐藥水平和耐藥特征，本研究于2019年從湖南省部分養殖場中分離了203株動物源大腸桿菌，進行了藥敏試驗分析，以期為湖南省動物源細菌耐藥性監測工作提供數據，同時為畜禽養殖過程中合理使用抗菌藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及培養基

Mueller-Hinton肉湯(MHB)、LB瓊脂、緩沖蛋白胨水(BPW)、麥康凱瓊脂(MacConkey Agar)培養基和伊紅美藍(EMB)培養基均購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 標準菌株

大腸桿菌藥敏試驗質控菌株ATCC 25922為本實驗室保藏。

1.3 藥敏檢測板

藥敏檢測板購自上海星佰生物技術有限公司，包含預制的具有固定稀釋梯度的氨芐西林(AMP)、奧格門丁(阿莫西林/克拉維酸鉀，A/C)、慶大霉素(GEM)、四環素(TET)、大觀霉素(SPT)、氟苯尼考(FFC)、磺胺異噁唑(SF)、復方新諾明(SXT)、頭孢噻呋(CEF)、頭孢他啶(CAZ)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、美羅培南(MEM)、安普霉素(APR)、黏菌素(CL)和乙酰甲喹(MEQ)等16種抗生素。

1.4 采樣和分離方法

2019年10月從湖南省郴州市、常德市、寧鄉市和株洲市的19個畜禽養殖場采集新鮮糞便樣品，每個場采集新鮮糞便15份。采樣場點包括減抗示范場5個和非減抗示范場14個，涉及雞場14個、豬場3個、鴨場2個。

將糞便和肛拭子樣品轉接到BPW中，37 ℃增菌12 h，然后在麥康凱瓊脂培養基上進行劃線分離。37 ℃培養12 h，挑取可疑菌落(鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，邊緣整齊)在EMB上再次劃線驗證，37 ℃培養12 h，挑取可疑菌落(金屬綠色)至LB瓊脂上進行劃線，培養16 h后挑取單菌落進行細菌質譜鑒定。將驗證確定的大腸桿菌菌株用20%甘油保藏至-80 ℃下備用。

1.5 接種菌懸液制備

將上述分離保藏的大腸桿菌在LB瓊脂培養基上分離劃線，純化2次后，用接種環挑取5～10個單菌落至無菌生理鹽水中，配制0.5麥氏濁度的懸浮液(約為1.5×108CFU/mL)；用MHB對菌懸液進行稀釋，使得最終接種菌液濃度為5×105CFU/mL至10×105CFU/mL。

1.6 藥物敏感性試驗及結果判讀

采用微量肉湯稀釋法(微量孔板)檢測16種抗生素對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)，依據美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute of America，CLSI)的相關藥敏折點判定標準，判斷菌株是否耐藥，并且以敏感(S)、耐藥(R)、中介(I)表示[13]。其中安普霉素和乙酰甲喹暫未有折點。大腸桿菌ATCC 25922作為質控菌株。

2 結果

2.1 大腸桿菌分離與藥敏檢測

從湖南省4市的19個畜禽養殖場分離大腸桿菌203個，每個場分離出菌株數1～15株，平均每個場10.7株。從雞場、鴨場和豬場分別分離出的菌株數分別為146、20和37株大腸桿菌。

203株大腸桿菌對16種抗生素的藥物敏感性檢測結果如圖1所示。根據測得的MIC分布規律來看，本研究中分離的菌株對大部分抗生素的耐藥譜較寬，其中氨芐西林、四環素、磺胺異噁唑、復方新諾明等抗生素的MIC明顯較高，表現出高度的耐藥。相反，美羅培南、黏菌素的MIC則明顯處于低位。所有受試菌株對氨芐西林和四環素的耐藥率最高(圖2)，均在80%以上；其次是磺胺異噁唑、復方新諾明和氟苯尼考，耐藥率分別為74.9%、73.9%和67.0%。受試菌株對氨基糖苷類藥物的耐藥性在不同藥物間存在較大差異，對大觀霉素的耐藥率較高(53.2%)，對慶大霉素的耐藥率較低(19.7%)。203株大腸桿菌對頭孢類藥物的耐藥率較低，對頭孢他啶耐藥率為2.5%，對奧格門丁的耐藥率僅為2.0%。此外，對黏菌素的耐藥率為0.5%，同時對美羅培南均敏感。通過此次的藥敏結果可以發現，大腸桿菌的耐藥性和抗生素的使用量相關性很強，對養殖中常用抗生素耐藥率較高(四環素類、氟苯尼考、磺胺類)，而對禁用或處方治療藥耐藥率極低(頭孢噻呋、頭孢他啶、奧格門丁、美羅培南、黏菌素)。

注：黃色代表耐藥(R)，綠色代表中介(I)，藍色代表敏感(S)；A～P分別為氨芐西林、奧格門丁、慶大霉素、大觀霉素、四環素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、復方新諾明、頭孢噻呋、頭孢他啶、恩諾沙星、氧氟沙星、美羅培南、安普霉素、黏菌素、乙酰甲喹圖1 203株大腸桿菌對不同抗生素的最小抑菌濃度數量統計

圖2 203株大腸桿菌的耐藥率

2.2 不同養殖場來源的大腸桿菌耐藥情況比較

從不同來源3種養殖動物中都分離出了大腸桿菌，見表1。雞源大腸桿菌對四環素(87.7%)、氨芐西林(85.0%)、磺胺異噁唑(78.1%)、復方新諾明(75.3%)、氟苯尼考(67.1%)5種抗生素的耐藥率超過50%。鴨源大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率最高(90.0%)，其次是四環素(85.0%)、復方新諾明(85.0%)、氟苯尼考和磺胺異噁唑(均為65.0%)。豬源大腸桿菌對四環素的耐藥率最高(97.3%)，隨后是對氨芐西林(81.1%)、大觀霉素(67.6%)、氟苯尼考(67.6%)、磺胺異噁唑(67.6%)和復方新諾明(62.2%)的耐藥率較高(表1)。此外，雞源大腸桿菌對頭孢噻呋、頭孢他啶、恩諾沙星、氧氟沙星4種抗生素的耐藥率均高于鴨源和豬源。盡管不同動物源的大腸桿菌數目差異較大，但是一定程度反映了各個動物來源的菌株耐藥性水平均處在高位。

表1 不同動物源大腸桿菌對14種抗生素的耐藥率統計結果 /%

此次調查同時比較了減抗示范場和非減抗示范場來源的大腸桿菌耐藥差異，見表2。分離的203株大腸桿菌中有52株來源于減抗示范養殖場，無論是減抗示范養殖場還是非減抗養殖場大腸桿菌分離株均對氨芐西林、四環素、磺胺異噁唑、復方新諾明和氟苯尼考表現出較高的耐藥性(>60%)；減抗示范養殖場大腸桿菌分離株除對奧格門丁、美羅培南、黏菌素表現出全部敏感外，對其他藥物均具有不同程度的耐藥。此外，減抗示范養殖場大腸桿菌對氟苯尼考的耐藥率顯著高于非減抗示范養殖場，而對恩諾沙星的耐藥率顯著低于非減抗示范養殖場(P<0.05)，對于其余12種抗生素的耐藥水平無顯著差異。這個結果表明，減抗示范場的細菌耐藥性相比其他養殖場并沒有明顯差異。

表2 不同類型養殖場分離的大腸桿菌對常用抗生素的耐藥率

2.3 大腸桿菌多重耐藥性分析

多重耐藥性是評價細菌耐藥性水平的另外一個指標。203株大腸桿菌對14種抗生素的多重耐藥結果如圖3所示。除11株大腸桿菌對所用藥物全部敏感外，其余192株菌對至少一種藥物耐藥。178株菌(87.7%)對3種及以上的抗生素有耐藥性，其中3～5種抗性有87株(42.9%)；6～9種有60株(29.6%)；9～11種有31株(15.3%)。203株大腸桿菌的耐藥譜如表3所示。

表3 湖南省203株大腸桿菌的耐藥譜

圖3 203株大腸桿菌對14種抗生素的多重耐藥分布

本研究中，203株大腸桿菌共有60種耐藥譜型，優勢耐藥譜型為AMP-TET-FFC-SF-SXT和AMP-SPT-TET-SF-SX，分別占比9.4%和7.39%。有兩株菌對11種藥物耐藥，譜型分別是AMP-A/C-GEM-SPT-TET-FFC-SF-SXT-CEF-ENR-OFL和AMP-GEM-SPT-TET-FFC-SF-SXT-CEF-CAZ-ENR-OFL。另外，有5.42%的菌株對14種藥物均敏感。此次結果說明，大腸桿菌多重耐藥比例很高，一定程度上反映出養殖場中細菌具有較高的耐藥水平。

續表3

3 討論

隨著養殖業規?；⒓s化的發展，使用抗生素作為飼料添加劑以預防和控制畜禽的細菌性疾病已經成為主要措施，然而抗生素的不合理使用和濫用導致了動物源耐藥細菌大量出現[14-15]。本研究對湖南省203株大腸桿菌的耐藥性監測結果顯示：所有菌株對四環素、復方新諾明、磺胺異噁唑、氨芐西林、氟苯尼考等5種抗生素的耐藥率，比對其他幾種抗生素的耐藥率高，這可能與這幾種藥物在畜禽養殖中大量使用有關[16]；對黏菌素的敏感率接近100%，這可能與黏菌素在2017年禁止作為飼料添加劑有關，呈逐年下降的趨勢[17]。對于大部分抗生素，2019年湖南省大腸桿菌仍然呈高水平耐藥。對氨芐西林的耐藥率(84.7%)相比2016年湖南部分豬場(88.5%，52株)[18]稍低，四環素耐藥率(89.2%)相比2013年湖南永州市(91.2%，91株)[19]和2009湖南西部地區(96.6%，147株)[20]的報道也有所降低。但是，動物源細菌耐藥性數據來源較少，且缺少統一的監測方法、標準和藥物范圍，所以往往難以準確的比較耐藥水平差異。

對分離自不同類型養殖場的菌株耐藥性比較發現，除氟苯尼考和恩諾沙星外，減抗示范養殖場菌株對其余6種抗生素的耐藥率數值上雖然低于非減抗養殖場菌株，但并沒有統計學上的差異。這提示我們減抗示范養殖場需要做細菌耐藥性水平評估，耐藥性水平下降需要長期的過程。

質粒介導的獲得性耐藥基因豐富多樣，可通過接合轉移和轉座子插入等方式水平轉移至受體細菌，導致多重耐藥現象傳播。即使使用一種抗生素，也可能對多重耐藥質粒具有選擇壓力，導致質粒長期存在，這無疑會對細菌耐藥性的防控工作帶來巨大阻礙。此次分離的動物源大腸桿菌的耐藥譜以抗氨芐西林/四環素/氟苯尼考/磺胺異噁唑/復方新諾明為主，耐藥譜類型達60種，下一步可以通過高通量測序探討是否主要與質粒介導相關。此次研究提示，實際養殖過程中應減少上述抗生素的使用，避免長期使用同種或同類抗生素，盡量交替用藥。另外，黏菌素作為飼料添加劑在2017年已被禁用，目前來看大腸桿菌對其耐藥性下降效果明顯，可為獸醫臨床治療帶來福祉。