同步分離培養大鼠肝星狀細胞和枯否細胞的方法研究

陳峰杰

河南護理職業學院，河南 安陽 455000

肝星狀細胞與枯否細胞作為肝內重要的非實質性細胞，也是肝纖維化的主要效應細胞，有促進肝纖維化進程的作用。活化的HSCs是肝纖維化發生的關鍵細胞和核心環節[1]，可轉化為肌成纖維細胞并分泌多種受體，生成大量細胞外基質，促進肝纖維化進程。KCs 可通過分泌的多種細胞因子，促使HSCs活化，參與肝纖維化過程。由于體內環節復雜多變，容易受神經、體液等多因素的影響，體外提取培養原代HSCs與KCs就顯得尤為重要。現實中HSCs僅僅占肝非實質細胞總數20～30%[2]，KCs僅占25～40%[3]，KCs和HSCs的形態、密度與其它肝非實質細胞非常接近，一直以來同步提取大鼠原代KCs和HSCs較難。自1982年Knook[4]報道提取肝星狀細胞方法后，國內相繼報道了多種改良的分離與提取方法[5-8]，但多數報道中的提取方法為單一細胞的分離培養[9-10]，多數方法存在分離過程繁瑣，成本高，細胞得率與純度低等問題。因此，建立簡便經濟的大鼠原代HSCs與KCs同步分離培養方法，是研究HSCs活化、肝纖維化發生機制的前提與基礎性工作。

1 材 料

1.1實驗動物 SD大鼠，清潔級，體重400-450g，購自山西醫科大學動物中心，普通飼料喂養。

1.2主要試劑 鏈酶蛋白酶、a-SMA抗體購自Sigma公司；Ⅳ型膠原酶購自Invitrogen公司；DNA酶購自北京索萊寶公司；Nycodenz購自Axis-Shield Pocoslo公司；DMEM培養基購自Gibco公司；RPMI1640購自美國HyClone公司；胎牛血清購自杭州四季青；Desmin抗體、武漢博士德公司的SABC免疫組織細胞化學試劑盒。

1.3主要儀器 Milli-Q Biocel超純水系統、Jouan IGO-150 CO2培養箱、生物倒置顯微鏡。

2 方 法

2.1大鼠門靜脈插管，鏈酶蛋白酶及膠原酶液原位灌注 SD大鼠，禁食12h后乙醚吸入麻醉，固定大鼠并用碘伏消毒腹部皮膚，呈“U”型剪開腹部，充分暴露肝臟、肝門靜脈，肝門靜脈插管并牢固固定導管，39℃前灌注液，20mL/min，灌注12-15min，剪開大鼠下腔靜脈，灌注的同時按摩灌注不良處，肝臟變白時游離肝臟。40℃鏈酶蛋白酶，5mL/min，灌注 25min，之后灌注37℃Ⅳ型膠原蛋白酶液，10mL/min，30min。

2.2密度梯度離心，制備混合細胞懸液 將循環灌注后的肝臟，移入超凈工作臺，去除表面被膜，加4mL DNA酶液和振蕩液，200-250次/min，37℃搖床恒溫振蕩30min。加入20mLDMEM液，過濾細胞懸液并收集上清液，10-15℃，1700r /min，離心5min。洗滌3次的細胞懸液中加入DMEM液，沿管底依次緩慢加入10.387%Nycodenz和18.8%的Nycodenz密度梯度液，10℃，20000r/min，離心25min。離心后可見在同一離心管中，因密度不同，原先的細胞懸液中出現明顯分層，HSCs與KCs位于細胞懸液的不同層面。

2.3HSCs與KCs同步分離純化 依據細胞分層情況，平頭針依次吸取位于不同層面的HSCs與KCs。DMEM 10-15℃，2000 r/min，5min離心洗滌HSCs三次，20%胎牛血清DMEM懸浮HSCs，用RPMI 1640 10-15℃，2000 r/min，5min離心洗滌KCs三次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640懸浮KCs。

2.4臺盼蘭拒染實驗判定細胞得率與活率 取10μL細胞懸液與10μL臺盼蘭充分重復吹打混勻，取10ul加到計數板凹槽，鏡下計數活細胞，臺盼蘭著色者為死細胞，未著色者為活細胞，計算細胞得率和活率。細胞懸液標本測定2次，取兩次均值。

2.5細胞培養 剛分離的HSCs與KCs分別按2.5×105/mL、1×106/mL密度接種，每孔加1mL細胞懸液，37℃、5% CO2培養箱培養。6h后吸棄KCs培養基，換成10%胎牛血清RPMI 1640培養液。48h后吸棄HSCs培養基，換含10%胎牛血清的DMEM培養液，每2-3d更換一次HSCs與KCs的培養液。

2.6細胞鑒定 使用Desmin及a-SMA抗體免疫細胞化學法鑒定原代培養7d的HSCs，SABC法免疫細胞化學染色。原代培養48h的KCs印度墨汁吞噬實驗驗證細胞吞噬能力，免疫細胞化學法鑒定KCs內溶菌酶表達情況。

3 結 果

3.1細胞形態觀察 鏡下可見，剛分離的HSCs可呈圓形、橢圓形，胞質內富含脂滴，折光性強，。24h后多數的HSCs貼壁。48h后少數HSCs伸出偽足，呈星形或多邊形。培養5d后的HSCs呈星形，細胞相互融合成片狀。7d 后HSCs內脂滴消失，多數細胞呈星形，部分融合呈片狀。培養14d 的HSCs，細胞完全伸展，呈現典型的成纖維細胞形態，胞質內有細胞骨架。新分離的KCs呈圓球形，大小均勻一致。4-6h后呈扁圓形，大部分細胞貼壁，少量伸出突起。24h后的KCs體積增大明顯，外觀呈圓形、三角形或星形。48h后KCs胞質內出現大量脂滴，核呈腎形。72h的KCs開始伸出偽足。培養7d的KCs完全伸展，甚至呈梭形。

3.2免疫細胞化學法鑒定所得細胞 a-SMA與Desmin免疫細胞化學染色后，可觀察到HSCs的胞漿呈棕黃色(見圖1)。溶菌酶免疫細胞化學染色后的KCs呈陽性，胞質內沉積的棕黃色顆粒清晰可見(見圖2)，表明本實驗成功同步分離培養了HSCs與KCs。靜止期與活化的肝星狀細胞均表達Desmin，僅活化的HSCs表達a-SMA。

3.3墨汁吞噬實驗來鑒定KCs吞噬能力 KCs以RPMI1640培養48h后，用少量印度墨汁加入KCs進行吞噬實驗驗證KCs吞噬能力。鏡下可見，KCs體積增大，胞質內大量碳素墨汁顆粒圍繞在細胞核周圍，表明分離培養的細胞KCs具有吞噬活性。

4 討 論

本實驗使用酶原位灌注消化和密度梯度離心相結合的兩步法。通過離體灌流鏈霉蛋白酶去除肝臟實質性細胞即肝細胞、Ⅳ型膠原酶去除膠原纖維，提高細胞得率和純度。HSCs與KCs密度有一定交叉，密度梯度離心液的選取和配置尤為關鍵。經過對比，本實驗使用的密度分離介質為 Nycodenz，具有性質穩定，配制簡單、價格適中的優勢。10.387%與18.8%Nycodenz密度梯度離心后HSCs與KCs位于細胞懸液不同層次，細胞分離界面清晰，通過一次實驗即可同步分離上述兩種原代細胞。而且提取的原代細胞與體內差異較小，可以很大程度反映細胞在體狀態。

本實驗所建立的HSCs和KCs同步分離培養方法，簡便經濟，又無需特殊設備和昂貴試劑，分離培養的原代HSCs與KCs生物學性狀良好，細胞得率、活率和純度高，達到后續實驗要求。該方法對于研究HSCs、KCs的生物學行為，KCs分泌細胞因子對于HSCs的作用及肝纖維化機制的研究奠定了細胞學基礎，值得推廣和廣泛使用。

圖1 培養7天的HSCs desmin免疫細胞染色(DAB顯色，×400)

圖2 KCs培養48h后溶菌酶免疫細胞化學(DAB顯色，×400)