水蛭及其提取液在眼科疾病中的應用和相關研究

黃 慧，鄭燕林，李園媛

0引言

2020版《中華人民共和國藥典》一部中收錄的水蛭為3種蛭的干燥全體，這種藥物性咸，味道苦，有少許毒性，主破血通經、逐瘀消癥[1]。水蛭屬于蟲類藥，這類藥物被譽為“血肉有情之品”，在臨床中常用于活血化瘀、通絡止痛、鎮痙熄風等，將蟲類作為藥物治療的歷史非常久遠，并且得到了廣泛應用。其中在《本草綱目》中記載“咸走血，苦勝血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝經血分藥，故能通肝經聚血”。隨著科技的發展和進步，經過不斷地研究顯示，水蛭中含有17種氨基酸以及蛋白質，其中包括8種人體必需氨基酸[2]，另含有水蛭素、吻蛭素、組織胺以及肝素等；在水蛭中還含有糖脂類、羧酸酯類以及蝶啶類等小分子；此外也含有14種微量元素，如鋅、鐵、錳、銅、硒、鈷、鉻、鉬以及鎳等[3]。水蛭可以起到抗炎、鎮痛、抗凝、抗纖維化、抗細胞凋亡、抗腫瘤等作用[4-8]，在心腦血管疾病、腎臟疾病、整形外科中廣泛應用。由于水蛭具有較強的活血化瘀作用，破瘀不傷新血，無損氣分，因此水蛭也可作為眼科破血逐瘀之要藥，并廣泛應用于眼科多種疾病的治療中。

1水蛭在眼科疾病中的應用

1.1年齡相關性黃斑變性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種發病率與年齡呈正相關的老年性疾病，雙眼先后或同時發病，視力呈進行性損害。中醫認為ARMD的產生和發展與肝脾腎存在密切關系，肝脾腎功能失調是本病主要的發病機制，濕性ARMD可誘發脈絡膜新生血管(choroidal neovascularisation，CNV)形成，CNV的發生是由于患者氣血津液的失調導致眼底水液、痰濕、瘀血等病理產物的堆積，在發病的全過程中，痰濕、淤血貫穿始終。仝小林教授認為水蛭為破血藥，主要應用于絡脈瘀滯疾病[9]，所以水蛭治療ARMD主要以化痰通絡散瘀為主。孟文明[10]通過觀察活絡散結湯(方藥組成含水蛭15g)治療26例痰瘀互結證濕性ARMD的臨床療效，以視力提高1行以上為有效，發現治療組的有效率可達77%。唐文婷[11]采用自擬補益肝腎祛瘀湯(方劑含水蛭6g)聯合西藥治療ARMD患者42例，以治療前后視力變化、黃斑區視網膜厚度以及視物模糊癥狀的改善情況進行療效評定，結果顯示治療總有效率為92.9%，高于對照組(單純使用西藥治療)的75.6%，兩組不良反應發生率的比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示自擬補益肝腎祛瘀湯的應用具有較高安全性，可長期服用。楊玉青等[12]觀察益氣養陰散結通絡湯(方劑含水蛭3g)治療氣陰兩虛，痰瘀阻絡證型濕性ARMD的臨床療效，觀察患者治療前后視力、30°視野及黃斑區視網膜厚度的改善情況，治療組總有效率76.92%，高于對照組的62.86%，差異有統計學意義(P<0.05)，提示此方能明顯改善濕性ARMD患者的癥狀。

1.2糖尿病性視網膜病變糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)的基本病理過程主要為視網膜微血管的病變，是糖尿病微血管并發癥之一。中醫認為DR的發病機制在于消渴日久，耗氣傷陰，以氣陰兩虛、陰陽兩虛為本，以脈絡瘀阻、痰濁凝滯為標，治療常常予以益氣養陰、活血化瘀。由于DR歸屬絡脈病變范疇，動物藥的最大特點是動而不居，性善竄透，能深入體細道窄的絡脈之中，以深搜細剔絡中伏邪[13]，因此水蛭常用于絡脈病的治療，作用機制可能在于改善微循環等。國內外研究也表明天然水蛭素可能通過阻斷PARS/p38/NF-κB等途徑降低大鼠皮瓣炎癥反應，具有改善微循環的潛能[14-15]。臨床使用含水蛭的中成藥治療非增殖期DR的療效已取得了一定的進展，如芪明顆粒(成分：水蛭、黃芪、葛根、地黃、枸杞子、決明子、茺蔚子、蒲黃)。一系列的臨床試驗發現芪明顆粒能夠提升非增殖期DR患者的視力，改善黃斑水腫情況，使視網膜及脈絡膜的血流加快，眼部血液循環得到改善，延緩DR的進展，且療效安全，不良反應發生率低[16-19]。

1.3白內障白內障(cataract)的發生機制較為復雜，任何影響眼內環境的因素都可以直接或間接破壞晶狀體的組織結構，其中晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)過度凋亡是年齡相關性白內障產生的原因之一[20]。中醫則認為白內障的發病機制在于年老肝腎虧虛，精血不足，或因脾胃虛弱，肝熱上擾致晶珠逐漸混濁。目前與水蛭相關的藥物治療白內障多與LECs相關，由福建省第二人民醫院研制的復方水蛭滴眼液(SZ)是以民間驗方為基礎，以水蛭為主要成分，目前已經獲得專利權，SZ可減緩實驗大鼠半乳糖白內障，其作用機制在于減輕因紫外線照射引起的LECs損傷，提高LECs核內的DNA含量，從而起到防護紫外線照射引起LECs凋亡的作用[21]。在一項為期6mo的SZ治療年齡相關性白內障100眼的臨床觀察中，以矯正視力和晶狀體混濁程度為療效觀察指標，結果顯示SZ組有效率(66%)明顯高于對照組(2%)(P<0.01)，且只有少數患者出現了不良反應，說明了其用藥的安全性[22]。

1.4視網膜靜脈阻塞視網膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)的發病率僅次于DR，是較為常見的視網膜血管疾病，黃斑水腫和視網膜新生血管出血是RVO眼視力喪失的兩個主要原因。中醫臟腑學說認為RVO多因痰熱內生，氣滯血瘀，或因脾胃虛弱，脾不統血引起的血溢脈外，或因陰虛陽亢、氣血逆亂，血不循經而溢于目內；以經絡學說來看，目絡為絡脈在眼部的延伸，具有滲灌氣血、聯系臟腑的作用，“以通為用”是目絡重要的生理特點[23]，因此視網膜阻塞性血管疾病療法主要以通為主，兼以益氣養陰。水蛭善破血逐瘀，通絡散結，因此中藥水蛭對于視網膜缺氧缺血性的血管病變具有良好的活血通絡作用，有助于眼底出血后的吸收、黃斑水腫的減輕以及預防新生血管的形成。在一項中醫臨床試驗中，采取分期治療RVO，并對治療效果進行觀察顯示，采用“化瘀散結片(成都中醫藥大學附屬醫院眼科研制并以水蛭為主藥)”配合“益視片”治療RVO干血期或者死血期，試驗組療效優于對照組[24]。另有研究顯示應用眼絡通方(由水蛭、地龍、葛根、川芎、三棱組成)治療兔RVO模型，兔視網膜組織中各時間點血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)和血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA及蛋白表達量均較模型對照組顯著降低，推測其抑制新生血管形成的作用機制可能與下調VEGF和PDGF在視網膜組織中的高表達有關[25]。

1.5其他眼科疾病研究發現化瘀散結片(以水蛭為主藥)可以促進玻璃體積血吸收，對防治增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreous retinopathy，PVR)的發生發展有一定作用[26-27]?；錾⒔Y片也能運用在視網膜脫離術后的視功能恢復，治療組服用化瘀散結片治療1、3mo后的視力療效顯效率分別為51.61%和58.06%，且治療3mo后治療組顯效率明顯高于對照組，說明化瘀散結片能有效改善視網膜脫離術后患者的玻璃體混濁，加快視網膜下積液吸收，促進視網膜平伏，有利于視功能的恢復[28]。

此外，由于蟲類藥物具有通經活血、化痰散結的作用，一些學者認為水蛭對甲狀腺相關眼病也有著不錯的療效。陳如泉教授認為甲狀腺相關眼病的發病機制在于肝氣郁久化火，痰瘀互結，或因肝脾不和，脾虛水濕聚而成痰，日久循經上行于目，痰血瘀阻于眼眶，水蛭破血逐瘀，能軟堅散結，配合其他活血通絡類藥物可共奏化痰散結之功效[29]。但水蛭在甲狀腺眼病的臨床應用未進行確切的療效評估，需要做進一步的臨床試驗來觀察其療效是否可靠。

2水蛭提取液在眼科中的研究現狀

目前水蛭提取液在眼科基礎研究中常見有3種提取方式：(1)水蛭滲濾液[30]：水蛭粗粉定量，加體積分數75%乙醇200mL，使均勻潤濕，加蓋，放置2h，裝入滲濾筒中，添加體積分數75%乙醇高出藥面3cm，排除筒內空氣。加蓋放置48h后放出藥液，流速3mL/min，并從藥面不斷添加體積分數75%乙醇5000mL，滲濾液回收乙醇至無醇味，定容至實驗所需量，藥液經60Co照射滅菌，備用。(2)水蛭水提醇沉提取液[31]：取水蛭定量，加水煮3次，每次加水8倍，煎煮1h，濾過，合并3次濾液，濃縮至200mL，加95%乙醇，使含醇量至75%，靜置過夜，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，定容，藥液經60Co照射滅菌，備用。(3)水蛭水提液[32]：水蛭干粉直接溶于PBS中，按一定比例混合浸提30min，濾過后備用。對于以上3種水蛭提取物的濃度均是根據《中華人民共和國藥典》中使用凝血酶測定水蛭提取液中水蛭素的濃度來計算。

2.1水蛭滲濾液

2.1.1對新生血管的調控作用有研究顯示，64g/L水蛭滲濾液會導致RF-6A血管內皮細胞跨膜受體VEGFR2的表達大幅降低，抑制了血管內皮細胞增殖，推測可能是因為水蛭滲濾液與VEGFR2有相互作用，競爭性抑制了VEGF與VEGFR2的結合[33]。在之后的一項實驗中發現凝血酶能夠在2、4、6、8、10h誘導RF-6A細胞TNF-α表達的增加，而64g/L水蛭滲濾液能夠抑制凝血酶誘導下TNF-α的表達，推測水蛭滲濾液通過阻斷凝血酶從而對視網膜血管內皮細胞TNF-α表達下調，減少新生血管的生成[34]。研究發現基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與新生血管的產生密切相關，其中研究最多的是MMP-2，64g/L水蛭滲濾液作用于RF-6A細胞，以MMP-2和Ⅳ型膠原為檢測指標，結果顯示64g/L水蛭滲濾液促進了體外凝血酶誘導下細胞微環境中Ⅳ型膠原的合成，抑制了MMP-2的分泌，改變了細胞生長的微環境，對新生血管的形成有抑制作用[35]。也有研究發現天然水蛭素在低濃度時可促進血管生成，而在高濃度時可抑制血管生成[33]，提示水蛭滲濾液對血管內皮細胞的生成可能有著一定調控作用，主要在于減少VEGF和TNF-α等促血管生成因子的表達，抑制MMPs等酶的分泌，改變細胞生長的微環境，從而抑制血管內皮細胞增殖，對新生血管的產生有著一定的影響。

2.1.2抗增生作用由于視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)是參與PVR的主要細胞之一，RPE受到不同刺激，重新進入細胞周期，使RPE異常增殖造成PVR的發生。鄭燕林等[36]研究發現不同濃度凝血酶均有不同程度促進RPE增殖作用，128mg/mL水蛭滲濾液對凝血酶誘導的RPE增殖具有抑制作用。一系列的研究發現水蛭滲濾液對RPE抑制的作用機制可能與P38 MAPK信號轉導通路以及G蛋白信號通路等有關[37-38]。Bastiaans等[39]通過研究得出結論，天然水蛭素可以顯著降低增生性玻璃體病變患者玻璃體內凝血酶活性，抑制RPE促炎和促纖維化途徑。這與水蛭素發揮抗凝的功效基本一致，因此我們推測水蛭滲濾液發揮抗增生作用機制的有效成分之一為水蛭素。

2.1.3轉分化作用本課題組前期實驗發現64g/L水蛭滲濾液可在體外誘導RPE形態類似神經元樣細胞改變，并表達神經元特異性蛋白NSETIN，提示水蛭有誘導體外RPE向神經元分化的趨勢[40]，因此水蛭具有調節視網膜干細胞活性及定向分化作用，并將分化細胞進行視網膜下腔移植來治療退行性視網膜病變等是具有研究前景的。但由于水蛭的成分十分復雜，水蛭滲濾液發揮轉分化作用機制的有效成分尚不明確，仍需做更深入的探索。

2.2水蛭水提醇沉提取液LECs與白內障的發生發展密切相關，LECs的過度凋亡或者異常增殖均可能引起不同類型的白內障發生。周春陽等[31]通過觀察體外培養LECs，模擬白內障囊外摘除術[extra capsular cataract extraction (cataract surgery)，ECCE]術后后發性白內障的發生發展過程，發現水蛭水提醇沉提取液對體外培養的牛LECs有明顯生長抑制作用，其24、72h ID50分別為31.85、30.69mg/mL，經比較差異無顯著性(P>0.05)，且經作用24h后，觀察到水蛭水提醇沉提取液能抑制LECs的貼壁，這為水蛭用于防治后發性白內障提供了實驗依據。重組水蛭素與天然水蛭素的結構、藥理作用高度相似[41]，孫宇等[42]研究發現重組水蛭素經眼部黏膜給藥后可以使半乳糖性白內障大鼠的晶狀體混濁度減輕，可能是由于提高了超氧化物歧化酶(SOD)的活性，降低了晶狀體中過氧化產物—丙二醛(MDA)濃度，LECs細胞膜穩定性和抗脂質過氧化能力逐漸恢復，從而達到預防和治療白內障的效果。重組水蛭素變異體Ⅲ(rHV3)對半乳糖介導的LECs損傷均具有較好的保護作用，rHV3能夠顯著降低高糖環境下LECs的p53表達，其抗細胞凋亡作用的機制之一是通過p53抑制線粒體介導的凋亡途徑來起到對LECs的保護作用[43-44]。水蛭水提醇沉提取液具有抑制LECs生長的作用，而重組水蛭素以及其變異體具有抗LECs凋亡的作用，推測水蛭的不同提取方法可能影響其有效成分發揮不同的藥理作用，但其中具體的作用機制尚待進一步證實。

2.3水蛭水提液由于水蛭素具有強大的抗凝血功能，故有利于藥物進入組織殺滅腫瘤細胞。李園媛等[32]使用水蛭素濃度為0.04、0.08U/mL的水蛭水提液體外作用于人視網膜母細胞瘤細胞(WERI-RB-1)，對細胞的增殖、凋亡以及侵襲能力進行檢測，研究結果表明水蛭水提液可以有效抑制WERI-RB-1細胞的增殖和侵襲，并能誘導細胞凋亡，有望能成為視網膜母細胞瘤的治療藥物，但其分子機制還需深入研究。

3小結與展望

中藥水蛭的功效多為破血通經、逐瘀消癥，因此水蛭目前在眼科疾病中多用于各種血證的治療，其發揮作用的機理主要為抗VEGF、改善微循環障礙、抗細胞凋亡以及抗增生等，通過臨床研究數據顯示均取得了一定療效。對水蛭提取液的研究也在不斷深入與創新，如水蛭提取液可能誘導細胞分化、水蛭水提液可以有效抑制視網膜母細胞瘤細胞增殖等，這為中藥發揮其多元化的特性治療視力喪失性眼科疾病提供了更多方向。

然而，由于中藥成分的復雜性，水蛭及其提取液的臨床應用和基礎研究依然存在許多問題：(1)水蛭入藥治療眼病以復方和中成藥為主，中藥復方等成分組成極其復雜，因此不能判定發揮作用機制的主要藥物是否為水蛭，水蛭的有效成分組成至今未得到完全解釋；(2)水蛭的提取方式有多種，前期的研究顯示不同的提取方式可能使水蛭發揮不同的藥理作用，但目前水蛭的提取方式尚缺乏標準的質量控制體系，因此不能確定水提取液的穩定性和絕對有效性；(3)水蛭古今醫書均記載有毒，在《本經》中列為下品，雖據現代藥理研究較為安全可靠，但在臨床應用時其用量安全問題仍未得到完全解決。因此未來對于水蛭的研究應該注重其成分分析，形成較為標準的中藥質量控制體系，使水蛭發揮作用的機制得到更全面的闡釋，提高水蛭應用的安全性和有效性。