Rho/ROCK信號通路在眼科疾病發生發展中的作用研究進展

郝一憲，魏慧霞，郭大東，畢宏生,3

0引言

大量研究發現，Rho/ROCK信號通路具有一系列重要的生物學功能，可以在細胞調控過程中起“開關”作用，并參與調控細胞增殖與分化、誘導細胞骨架重組、影響血管和組織通透性和應力纖維形成等。越來越多的研究表明，Rho/ROCK信號通路可調控多種眼組織細胞的生理功能，包括通過調控細胞增殖、上皮分化、細胞遷移和細胞黏附來影響角膜各層功能；控制細胞骨架重塑來調節晶狀體上皮細胞的遷移和增殖；調節小梁網收縮來控制房水流通；調控肌動蛋白和肌球蛋白，導致血管平滑肌收縮，影響眼內血流；誘導肌成纖維細胞的形成影響鞏膜重塑等(圖1)。因此，Rho/ROCK信號通路在眼科疾病的發生發展中起重要的調控作用，本文就Rho/Rock信號通路在眼科疾病發生發展中的作用做簡要綜述，為臨床治療眼病提供思路。

1 Rho-GTP酶和Rho

Rho-GTP酶是控制所有真核細胞多種信號轉導途徑的重要分子開關，為20～30kD單體GTP結合蛋白，與Ras超家族蛋白有25% 的同源性[1-2]。哺乳動物Rho-GTP酶主要包括Rho(三種亞型：A，B，C)、Rac(1，2，3)、Cdc42、TC10、TCL、Chp(1，2)、RhoG、Rnd(1，2，3)、RhoBTB(1，2)、RhoD、Rif、和TTF[1]等類型。Rho蛋白受三類蛋白質的高度調控，即鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)，GTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein，GAP)和鳥嘌呤核苷酸交換抑制劑(guanine nucleotide exchange inhibitor，GDI)。在GEF的作用下，Rho蛋白由無活性的Rho-GDP狀態轉變為有活性的Rho-GTP狀態，并且GAP可以通過GTP的水解使Rho蛋白失活，而Rho-GDI可保護Rho蛋白免受泛素化[3]。

2 ROCK

Rho相關蛋白激酶(Rho-associated coiled-protein kinase，ROCK)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，包括兩種類型ROCK1和ROCK2。其中，ROCK1在肝、肺、腎、脾、睪丸和循環炎癥細胞中大量表達，而ROCK2主要存在于心臟、肌肉(包括平滑肌)和大腦中[4]。ROCK的結構包括三部分：位于分子結構氨基端的催化區，位于分子結構羧基端的PH結構域，以及包含Rho-GTP結合結構域的螺旋區。ROCK受到Rho-GTP酶的調控，參與控制多種生理功能，包括細胞收縮、遷移、增殖和黏附。ROCK可以使多種細胞內底物磷酸化，包括肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)、LIM激酶(LIM kinases, LIMK)、肌球蛋白磷酸酶靶蛋白(myosin phosphatase target protein，MYPT-1)等，并通過與這些底物的相互作用調控肌動球蛋白的收縮、細胞形態變化、細胞黏附、膜通透性等。

3 Rho/ ROCK信號通路在眼科疾病中的相關研究

3.1白內障白內障是有用視力喪失的最常見原因之一，全世界大約有1600萬人受到影響[5]。轉化生長因子-β(transforming growth factor，TGF-β)誘導的上皮-間質轉化可導致眼部纖維化病變，在白內障發生發展過程中起促進作用。Korol等[6]證實TGF-β誘導的上皮-間質轉化(最終表達α-SMA)受肌動蛋白動力學的調節，其發生途徑是RhoA-ROCK-MRTF-A。Imaizumi等[7]發現，ROCK抑制劑Y27632抑制了TGF-β2依賴性誘導的小鼠晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)Ⅰ型膠原表達和UV-B照射誘導的前囊下白內障(anterior subcapsular cataracts，ASCs)形成，對ASCs的發生起抑制作用。因此，ROCK抑制劑可能是預防ASCs的候選藥物。在白內障術后，最常見的并發癥是由LECs的遷移和增殖引起的后囊混濁(posterior capsule opacification，PCO)。Lin等[8]發現，ROCK通路可以通過cofilin激活、CAPZA1和ERM蛋白家族表達來調節細胞骨架重塑，其中cofilin可以通過磷酸化調節LECs的遷移和增殖；經ROCK抑制劑Y27632-PLGA改良后的人工晶狀體可明顯抑制PCO的發展。因此，改良人工晶狀體可明顯阻止PCO的形成，有望成為臨床預防PCO的有效途徑。

3.2青光眼青光眼是一組不可逆的進行性視神經疾病，可導致嚴重的視野喪失和失明[9]，表現為房水流通受阻或流通速度下降而導致的眼壓升高。在青光眼房水中可以觀察到多種細胞因子濃度的改變，其中包括TGF-β水平的增加[10]。Rho蛋白可以通過刺激分泌的生物活性分子受體(如內皮素-1、凝血酶、血管緊張素Ⅱ、溶血磷脂酸、TGF-β和細胞因子)被激活，也可以通過與細胞外基質結合后由整合素激活[11]。Pattabiraman等[12]利用慢病毒作為基因載體，研究大鼠房水流出通道中RhoA-GTP酶(RhoAV14)持續表達對眼壓的影響，發現在小梁房水通路中，因RhoAV14失活可導致成纖維細胞活性增加，并以ROCK依賴的方式升高大鼠的眼壓。Montecchi-Palmer等[13]發現TGF-β2通過Smad和非Smad依賴性途徑誘導人小梁細胞內交聯肌動蛋白網絡的形成，且ROCK抑制劑對肌動蛋白應力纖維具有破壞性，因此房水流出受阻和眼壓升高可能是由于Rho/ROCK信號傳導途徑的激活，使用Rho/ROCK信號通路抑制劑可能在青光眼治療中發揮作用。

3.3視神經相關病變

3.3.1視神經損傷常見的視神經病變包括青光眼性視神經病變和外傷性視神經損傷。視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells, RGCs)的逐漸喪失和相關的視野缺損是青光眼性視神經病變的典型標志，而RGCs的凋亡會導致視力損害和失明[14-15]。Yu等[16]發現視網膜RhoA/ROCK信號在外傷性視神經病變中被激活；同時，中樞神經損傷后，RGCs上調表達Nogo-髓鞘相關糖蛋白(Nogo myelin-associated glycoprotein，Nogo-A)，這是一種富含髓鞘的中樞神經系統軸突生長和再生抑制蛋白[17]。Nogo-A與細胞膜上的受體結合后將信號傳入細胞內，激活RhoA-ROCK-LIMK-Cofilin信號通路，調控肌動蛋白和肌球蛋白從而引起細胞生長錐的塌陷，抑制神經軸突的生長[18-19]；Yu等[16]研究證實，ROCK抑制劑法舒地爾(Fasudil)可通過作用于Rho/ROCK信號通路減輕RGCs的損傷，降低Nogo-A和ROCK-2基因的表達，從而減輕視神經損傷。

3.3.2缺血性視神經病變缺血性視神經病變根據視神經乳頭(optic nerve head, ONH)的腫脹部位分為前部和后部兩種類型[20]。青光眼眼壓升高可增加ONH篩板上的機械力，使RGCs軸突功能受損，同時，隨著ONH中RhoA蛋白水平顯著增加，Rho/ROCK信號通路調控肌動蛋白和肌球蛋白作用增強，導致血管平滑肌過度收縮，最終導致ONH缺血[21-23]。Sugiyama等[24]研究發現，局部或全身注射ROCK抑制劑法舒地爾抑制L-NAME或內皮素-1誘導的ONH血流量減少以及ONH功能和形態的損害。Chihara等[25]研究表明，外用ROCK抑制劑利帕舒地爾(Ripasudil)增加了原發性開角型青光眼和高眼壓的ONH

圖1 Rho/ROCK 信號通路活化作用簡圖 GEF：鳥嘌呤核苷酸交換因子；GAP：GTP酶激活蛋白；MLC：肌球蛋白輕鏈；LIMK：LIM激酶；ERM：(Ezrin/Radixin/Moesin) 蛋白家族；MRTF-A：心肌相關轉錄因子-A；SRF：血清反應因子。

淺周血管密度，擴張毛細血管周圍血管。因此，ROCK抑制劑可作為缺血性視神經病變的治療方法。

3.4視網膜相關病變

3.4.1糖尿病性視網膜病變對糖尿病患者而言，糖尿病視網膜病變是致其失明的主要原因[26]。Arita等[27-28]在糖尿病大鼠的視網膜微脈管系統中觀察到顯著的Rho/ROCK活化，應用ROCK抑制劑法舒地爾，使糖尿病大鼠視網膜內皮型一氧化氮合酶的磷酸化水平顯著增加，并且降低MYPT-1磷酸化和細胞間黏連分子-1表達，通過抑制白細胞黏附并減少白細胞誘導的內皮損傷來保護血管內皮。事實上，抑制Rho/ROCK通路可調節血管內皮細胞從而抑制血管內皮生長因子誘導的血管生成[29]。Hollanders等[30]用ROCK抑制劑AMA0428靶向Rho/ROCK通路可有效減少早期糖尿病視網膜病變改變。Rothschild 等[31]發現在2型糖尿病視網膜中，視網膜內皮細胞和視網膜色素上皮細胞中的ROCK-1信號激活，可誘導細胞骨架重塑，進而導致微血管閉合和視網膜缺氧，并破壞視網膜色素上皮屏障和滲漏，而眼內注射法舒地爾能有效逆轉該損害。

3.4.2年齡相關性黃斑變性年齡相關性黃斑變性是視網膜色素上皮和神經感覺性視網膜的退行性病變，其特征是視網膜色素上皮喪失、脈絡膜新生血管、色素上皮脫離和黃斑纖維瘢痕形成[32-33]。Hollanders等[34]發現在體外瓊脂糖遷移實驗中，ROCK抑制劑AMA0428可減少人腦微血管周細胞中肌球蛋白磷酸化，并誘導應力纖維和局灶性黏連的丟失，從而促進該細胞的遷移和招募，促進血管的成熟，且AMA0428在激光誘導的脈絡膜新生血管小鼠模型中具有抗炎、抗血管生成和抗纖維化作用。

3.4.3視網膜脫離視網膜脫離最明顯的特征是桿狀細胞軸突及其末端從外突觸層向細胞本體的回縮[35]。RhoA/ROCK信號通路在受傷后可迅速活化，促進軸突回縮[36]。Wang等[37]發現視網膜脫離后，通過RhoA-ROCK-LIMK通路，使cofilin磷酸化增加，促進了視桿感光細胞肌動蛋白纖維的解聚，從而有助于視桿軸突損傷后的收縮。

3.5角膜內皮疾病角膜內皮層為角膜最內層，靈長類角膜內皮細胞(corneal endothelial cell，CEC)是不可再生的，因此CEC的任何損傷都只能通過代償性遷移和殘余CEC的擴散來修復，以覆蓋受傷區域，從而導致CEC密度下降，當低于臨界水平(通常小于500～1000cell/mm2)時，可能導致角膜混濁[38]。研究發現，ROCK抑制劑可加速角膜內皮傷口愈合，從而導致具有高內皮細胞密度的角膜內皮單層細胞再生[39]。Okumura等[40]證實ROCK抑制劑Y-27632通過抑制Rho/ROCK信號通路，促進CEC的黏附，抑制細胞凋亡，來增加CEC細胞的數量。在角膜受損的傷口愈合過程中，新生血管的生成以及纖維化可損害視力，ROCK抑制劑AMA0526在體外能有效抑制血管生成，并可減輕炎癥反應和Ⅲ型膠原沉積，從而有效控制創面愈合的全過程[41]。

3.6近視近視作為一種青少年常見的眼部疾病，其特征在于眼軸的過度增長。大量實驗和臨床證據表明，與近視相關的眼球后段過度延長是鞏膜細胞外基質重塑改變的結果，該結果已被人近視眼鞏膜的結構和生物力學的變化所證實[42]。Yuan等[43]研究發現鞏膜成纖維細胞受到機械應力后可激活RhoA，通過RhoA/ROCK2-MRTF-A/SRF途徑，使得心肌相關轉錄因子-A(MRTF-A)核轉移，α-SMA表達增加，誘導其分化為肌成纖維細胞。另外，MDIA和ROCK在Rho引起的應力纖維形成過程中同時被激活，MDIA通過成核和聚合產生肌動蛋白細絲，而ROCK激活肌球蛋白使其交聯，從而誘導肌球蛋白束的收縮[44]。因此，Rho可能通過mDia1和ROCK途徑同時介導肌動蛋白組裝，從而影響近視的發生發展。

3.7葡萄膜炎特發性前葡萄膜炎是人類最常見的眼內炎性疾病，以虹膜和/或球囊的炎癥為特征[45]。Uchida等[46]研究發現，在內毒素誘導的大鼠葡萄膜炎中，ROCK抑制劑利帕舒地爾通過抑制細胞間黏連分子-1和MYPT-1的表達，以及通過抑制TNF-α/NF-κB來發揮抗炎作用，從而抑制白細胞黏附和炎性細胞浸潤。Yamada等[47]研究發現利帕舒地爾滴眼液對前葡萄膜炎患者的炎癥作用有很好的抑制作用，可能與ROCK信號通路抑制劑重新構建血-房水屏障有關。

4小結

綜上所述，Rho/ROCK信號通路參與了多種眼病的發生發展，深入探討Rho/ ROCK信號通路在眼病發生發展中的作用對治療眼病有很好的幫助和促進作用，相關的Rho酶抑制劑和ROCK抑制劑的開發也在相關眼病的治療過程中顯示出越來越大的潛力，并為治療眼病提供了更多的選擇和幫助。