補腎益精方對外周血BMSCs在干性ARMD小鼠中視網膜分化及CNTF表達的影響

許 凱，唐由之，梁麗娜，張 晶，侯 樂，梁 潔，陳 強，馬群英

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是發達國家50歲以上人群不可逆性盲的首位病因，在我國的發病率也呈逐年上升趨勢。根據有無視網膜下脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)分為干性ARMD和濕性ARMD。隨著對CNV研究的深入，通過藥物治療、激光光凝、光動力療法(photodynamic therapy,PDT)及手術等方法，濕性ARMD的治療已取得較好的臨床效果。干性 ARMD由于脂質過氧化物和氧自由基等在視網膜內蓄積，導致視網膜色素上皮 (retinal pigment epithelium，RPE) 細胞凋亡及感光細胞損傷，目前尚無確切的藥物療法[1]。近年來，干細胞研究的快速發展為干性ARMD的治療帶來了潛在的希望。補腎益精方是唐由之研究員治療干性ARMD的經驗方，前期動物實驗研究顯示該方對干性ARMD小鼠視網膜有一定的保護作用，并可以動員自體骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)向外周血遷移及向視網膜組織歸巢[2-3]。基于前期研究結果，本實驗觀察補腎益精方是否可以促進外周血干細胞向視網膜細胞分化以及視網膜組織中睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)的表達，以進一步明確其作用機制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組動物選用SPF級健康無眼疾C57BL/6小鼠36只，約6～8周齡，雄性[北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可證編號：SCXK(京)2016-0006]。適應性飼養7d后，按隨機數字表法選擇其中的24只予40mg/kg碘酸鈉(NaIO3)尾靜脈注射造模，并評定造模情況[3-4]，本研究納入動物均造模成功。

造模后第1d，尾靜脈注射3×106個綠色熒光蛋白標記的C57BL/6小鼠骨髓間充質干細胞(green fluorescent protein labeled bone marrow-derived mesenchymal stem cells，GFP-BMSCs)，然后隨機分為蒸餾水組及補腎益精方組，每組12只。干細胞注射后第1d，補腎益精方組予補腎益精方藥液灌胃(8.8g/kg)，每天1次。蒸餾水組每天予等量的蒸餾水灌胃。另選12只健康C57BL/6小鼠常規飼養作為正常組。治療14d時進行相關指標評價。動物實驗程序與福利均符合實驗動物倫理學要求。

1.1.2實驗試劑及儀器補腎益精方由何首烏、枸杞、黃芪、黃精等組成，煎劑由中國中醫科學院眼科醫院藥學部制備而成，濃度為880g/L。綠色熒光蛋白標記的C57BL/6小鼠骨髓間充質干細胞(GFP-BMSCs)購自Cyagen公司，NaIO3(SIGMA-ALDRICH公司)，Triton-100(北京優尼康生物科技有限公司)，牛血清白蛋白(BSA)(北京元亨圣馬生物技術研究所)，Anti-RPE65(ab78036)、Anti-Rhodopsin(ab5417)、Anti-GFAP(ab7260)、Anti-CNTF(ab46172)、Alexa Fluor? 647標記的驢抗小鼠 IgG H&L (ab150107)購自Abcam公司，羅丹明標記山羊抗兔IgG H&L(ZF-0316)購自北京中杉金橋生物技術有限公司，TaqDNA聚合酶(Amplied Biosystems公司)，Trizol Reagent RNA提取試劑盒(Ambion公司)，M-MLV Reverse Transcriptase cDNA第一鏈合成試劑盒(Invitrogen公司)，氯仿、異丙醇(北京化工廠)，loading buffer、DNA marker(北京優尼康生物科技有限公司)，CM1850冰凍切片機、DM2500顯微鏡(德國Leica公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)，熒光定量PCR儀(Amplied Biosystem公司)。

1.2方法

1.2.1免疫熒光染色頸椎脫臼法處死小鼠，立即摘除右眼眼球，制作冰凍切片。一抗孵育(Anti-RPE65，1∶500；Anti-Rhodopsin，1∶50；Anti-GFAP，1∶500；Anti-CNTF，1∶500), 4℃過夜；PBST洗滌3次，二抗孵育(Alexa Fluor? 647標記的驢抗小鼠 IgG H&L，1∶500；羅丹明標記山羊抗兔IgG H&L，1∶100)，避光室溫孵育2h；PBST洗滌3次，DAPI復染；PBS洗滌，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。計數每個視野中RPE65+、Rhodopsin+、GFAP+細胞(即紅色熒光)、GFP+細胞(即綠色熒光)以及RPE65、Rhodopsin、GFAP細胞與GFP雙染細胞(即黃色熒光)數量，計算比值[BMSCs分化率(%)=雙染陽性細胞數/同視野GFP+細胞數×100%)]，并進行統計分析。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測頸椎脫臼法處死小鼠，立即摘除左眼眼球，分離出新鮮視網膜，按Trizol Reagent RNA提取試劑盒說明書提取視網膜樣本中總RNA。應用M-MLV Reverse Transcriptase cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉錄合成cDNA，紫外分光光度計測定其濃度。以β-actin為內參，引物基因序列如下：CNTF：F5’-GCTTTCGCAGAGCAATCAC-3’，R5’-AGAGGCCACCATCTCCAAT-3’；β-actin：F5’-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3’，R5’-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3’。擴增條件為：95℃ 5min，(95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 15s)×45個循環，分析溶解曲線。采用2-ΔΔct方法進行數據的相對定量分析，ΔΔct=(實驗組目的基因平均ct值-實驗組內參基因平均ct值)-(對照組目的基因平均ct值-對照組內參基因平均ct值)。統計各組視網膜組織中CNTF mRNA的相對表達量。

2結果

2.1補腎益精方對GFP-BMSCs在視網膜分化的影響RPE細胞特異性抗體RPE65免疫熒光染色發現，正常組RPE細胞排列規整，呈強陽性(紅色熒光)染色；蒸餾水組和補腎益精方組RPE65陽性染色減少減弱，細胞排列不規整，可見散在RPE65及GFP雙染陽性細胞，兩組雙染細胞陽性率分別為(12.63±2.69)%、(14.32±5.57)%。雖然補腎益精方組的雙染色陽性細胞總數較蒸餾水組多，但陽性率兩組差異無統計學意義(P=0.857)，見圖1、2。感光細胞特異性抗體Rhodopsin免疫熒光染色發現，正常組Rhodopsin主要在感光細胞外節段表達，呈強陽性(紅色熒光)染色；蒸餾水組和補腎益精方組外節段結構紊亂，呈碎片化弱陽性染色，均可見GFP陽性細胞，但在外節段區未發現雙染細胞(圖3)。膠質細胞特異性抗體GFAP免疫熒光染色發現，正常組GFAP在星形膠質細胞、Müller細胞靠近視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells,RGCs)部位有少量表達(紅色熒光)；蒸餾水組和補腎益精方組GFAP陽性表達均較正常組增強，可見GFAP、GFP雙染陽性細胞。蒸餾水組在神經節細胞層可見較強GFAP陽性染色。補腎益精方組GFAP在神經節細胞層、內叢狀層呈垂直視網膜分布的線條狀陽性染色，內核層呈細點狀染色。補腎益精方組雙染細胞陽性率為(30.50±8.10)%，明顯高于蒸餾水組(15.65±3.89)%，兩組間差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2、4。

圖1 免疫熒光觀察各組視網膜RPE65表達情況(×400)。

圖2 兩組BMSCs分化率比較 bP<0.01 vs 蒸餾水組。

2.2補腎益精方對視網膜CNTF表達的影響

2.2.1免疫熒光檢測視網膜中CNTF蛋白表達情況結果發現，正常組CNTF在神經節細胞層表達，呈強陽性(紅色熒光)染色。蒸餾水組視網膜中表達較弱，僅在神經節細胞層、內核層有少量陽性細胞。補腎益精方組CNTF陽性表達雖然較正常組弱，但強于蒸餾水組，在神經節細胞層、內核層均可見大量陽性細胞，外核層有少量陽性細胞(圖5)。

2.2.2實時定量PCR檢測視網膜中CNTF mRNA表達情況三組CNTF mRNA表達比較差異有統計學意義(P<0.01)。蒸餾水組和補腎益精方組視網膜中CNTF mRNA的表達與正常組相比均增加，差異有統計學意義(P=0.047、0.038)。補腎益精方組較蒸餾水組顯著增加，差異有統計學意義(P=0.044)，見表1。

圖3 免疫熒光觀察各組視網膜Rhodopsin表達情況(×400)。

表1 給藥14d時各組視網膜CNTF mRNA表達情況

3討論

本研究選擇的動物模型是NaIO3誘導的干性ARMD模型，是目前國內外公認且應用較多的造模方法。研究顯示[5]，C57BL/6小鼠在注射NaIO36h后，RPE細胞出現壞死；24h后，感光細胞外節斷裂，并出現感光細胞凋亡；3d時，感光細胞凋亡達到高峰；7d時，感光細胞完全凋亡。此模型選擇性地引起RPE層損傷，繼而導致感光細胞等組織發生病理改變的特性與干性ARMD的發病特點相似。因此，選用該模型進行實驗。

對于干性ARMD的治療，雖然膳食補充劑療法在一定程度上減緩了疾病的進展，但還未發現其他療效確切的治療藥物。近年來，細胞替代治療方法的出現，尤其是干細胞研究的快速發展使干性ARMD的治療成為可能，并被認為是目前最有應用前景和臨床轉化潛能的治療策略之一[6]。盡管既往研究取得了一些成果，但仍存在不少問題，比如移植后視網膜功能改善維持時間短，移植細胞不能很好地整合于宿主細胞及分化成視網膜細胞等，如何解決這些問題是干細胞更好應用于臨床的關鍵。中醫學認為，精是人體生命活動的根本物質。“腎者主蟄，封藏之本，精之處也”，腎精充足，則能發揮化生的作用，這與干細胞的理論有相似之處。因此，通過補腎益精方，有可能通過增強自身BMSCs的修復能力，發揮保護視網膜變性損傷的作用。

補腎益精方是唐由之研究員治療干性ARMD的經驗方，該方以制首烏滋補肝腎、填精益髓；枸杞滋養肝腎，益精明目；黃芪補氣健脾；黃精補氣養陰，健脾益腎，諸藥合用，使精血暢達，上注于目，臨床上用于治療視網膜變性疾病。前期我們研究發現補腎益精方可以延緩先天性視網膜變性模型英國皇家外科學院(Royal College of Surgeons，RCS)大鼠視網膜細胞的凋亡[7]，促進外周血干細胞在視網膜的聚集及神經營養因子分泌[8]，另外，補腎益精方對NaIO3誘導的干性ARMD小鼠也有保護作用，并可以促進外周血BMSCs在視網膜歸巢[2-3]。歸巢后的BMSCs是否能分化為具有功能的視網膜細胞需要進一步探討。現代藥理學研究發現，制首烏可保護神經細胞，并促進神經干細胞向神經元分化[9-10]；枸杞可促進BMSCs向神經元分化，增加海馬神經元干細胞的分化速率，促進海馬神經元再生，保護神經系統[11-14]；黃芪可促使BMSCs的增殖、動員及向神經細胞分化[15-18]；黃精可促進BMSCs的增殖以及動員因子粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)的表達[19]。本實驗結果顯示補腎益精方不能促進BMSCs分化為RPE細胞和感光細胞，但是對分化為膠質細胞具有較為明顯的促進作用。在生理狀態下，膠質細胞起支持、指引神經元遷移、參與血-腦屏障的誘導及形成的作用，同時在維持細胞周圍微環境的穩態方面通過分泌多種細胞因子和神經遞質，參與激素和神經遞質的代謝，并在信號轉導和免疫調節等方面具有重要作用，其功能的完整性是正常視功能所必須的[20-22]。在視網膜損傷早期，膠質細胞為保護組織免受進一步損傷，會出現反應性的膠質增多，GFAP表達增加，釋放神經營養因子(neurotrophic factors, NTFs)和抗氧化劑，發揮神經保護作用[23-24]。其他研究也發現，無論是體內還是體外培養，MSCs在一定條件下都能分化成神經膠質細胞和神經元，表現出修復神經的功能，呈現向損傷處遷移的特性[25-26]。

圖4 免疫熒光觀察各組視網膜GFAP表達情況(×400)。

目前認為MSCs修復視網膜變性損傷的機制一方面在趨化因子介導下，遷移至損傷部位，并跨胚層分化為視網膜細胞，直接替代壞死或凋亡的細胞[27-31]；另一方面通過旁分泌作用產生CNTF、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)等NTFs以及抗凋亡相關因子等，使其在受損視網膜的微環境中表達上調，促進視網膜修復[32-35]。CNTF作為視網膜保護中被研究最多的神經營養因子之一，主要由膠質細胞和神經所支配的組織產生，對視網膜神經元具有明顯的保護作用[36-38]，研究表明，CNTF能增加外核層厚度，減少感光細胞凋亡，提高感光細胞的存活能力，延緩疾病發展[39-43]。并且可以顯著增強信號傳導及轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的磷酸化，調節感光細胞對光子的傳導性，保護視網膜細胞[44]。因此，本實驗觀察了補腎益精方對CNTF在視網膜表達的影響，結果發現補腎益精方組CNTF mRNA和蛋白的表達量較蒸餾水組均增加，提示補腎益精方可以促進CNTF的表達。另有研究發現，在中樞神經系統，膠質細胞在受損傷早期可以分泌CNTF。當中樞神經受損時，CNTF從膠質細胞中釋放，并在損傷區域周圍聚集[20,45]。在本實驗中，由于CNTF mRNA和蛋白表達量趨勢與膠質細胞特征性標志物GFAP相一致，因此我們認為補腎益精方一方面促進視網膜本身CNTF表達增加，另外也可能通過促進分化的膠質細胞釋放CNTF，保護受損視網膜。

圖5 免疫熒光觀察各組視網膜CNTF表達情況(×400)。

綜上所述，通過本實驗我們發現補腎益精方能夠促進BMSCs在干性ARMD小鼠模型視網膜分化為膠質細胞，并促進視網膜CNTF的表達，這可能是補腎益精方保護視網膜變性損傷的作用機制。