大鼠外傷性視神經損傷的閃光電生理特性和Tau蛋白及其磷酸化研究

王鵬飛，申 晨，喻哲昊，聶祖慶，李志偉，文 婕，李 萌，曹 霞

0引言

外傷性視神經損傷(traumatic optic neuropathy，TON)是指外力作用導致的視神經功能障礙[1]，可分為直接性損傷和間接性損傷。直接性損傷指外力直接作用于視神經造成的開放性視神經損傷[2-3]；間接性損傷多由于震蕩力經頭部傳遞至視神經管，引發視神經病理性改變，嚴重者可導致失明[3-4]。目前TON無特效治療方法，可通過視神經管手術減壓或皮質類固醇激素改善癥狀[5-8]。

TON除可直接導致視神經軸突損傷外，還可繼發誘導視網膜病變，進一步加劇患者的視覺障礙[9]。閃光視覺誘發電位(flash visual evoked potentials，FVEP)是評價視覺通路功能的常用方法[10]，閃光刺激導致的視覺電信號的振幅強弱可反映黃斑的接收功能和參與興奮的神經元數量；而電信號的潛伏響應程度可反映神經傳導和軸突髓鞘的完整性[11]。標準FVEP電位包含5個組份，含3個正向波P1、P2、P3和2個負向波N1和N2，其中N2和P2是成人FVEP中最一致和穩健的組份[12]，N2-P2的振幅變化常被臨床運用于監測視神經功能的完整性和預后提示[13-14]，異常的N2和P2波形可預測某些嚴重的退行性疾病[15]。在大鼠缺血性神經病變模型中，N2-P2波振幅可用于評估體內視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell，RGC)的結構和功能，RGC損失可導致N2-P2幅度衰減[16-17]。同時有報道稱顱內高壓造成的腦缺血、缺氧和乳酸沉積可減緩神經傳導速度，病理進展與FVEP電位潛伏期呈正相關，且N2波潛伏期的延長可作為TON預測的良好指標[18-19]。

Tau是一種微管相關蛋白，生理狀態下主要分布于細胞軸突。Tau通過選擇性磷酸化發揮穩定和促進微管形成的功能，可調節軸突運輸；病理狀態下，Tau通過過度磷酸化發生Tau聚集，分布異常，毒性增加，使得穩定微管的能力下降甚至喪失[20]。近期研究表明，在小鼠間接性TON模型中可出現內角膜水腫引起高眼壓和RGC丟失等病理變化，其中RGC出現Tau過度磷酸化等病變[21]。在大鼠青光眼模型中，Tau異常分布于RGC的樹突中，視網膜中Tau的Ser 396/404位表現出過度磷酸化現象[22]。在阿爾茨海默病轉基因小鼠(3×Tg)中，視網膜Tau的Ser 396/404位點卻沒有發生過度磷酸化現象，相反在Ser 202和Thr 205位點中發生了過度磷酸化[23]。因此，對于視網膜軸突受損的TON來說，Tau在其病理進展中發揮了關鍵作用，但其磷酸化變化可能與在其他疾病模型中探索出的改變模式有所不同。本研究通過構建大鼠TON模型，運用FVEP技術檢測大鼠TON后視覺通路障礙的變化情況，并分別探究大鼠TON后視神經軸突及視網膜中Tau及pTau-Ser 396/404的狀態變化。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級雌性健康成年SD大鼠30只(昆明醫科大學實驗動物中心提供)，雙眼外觀正常，檢查雙眼屈光間質清，瞳孔等大等圓，對光反射靈敏，眼底無異常，體質量約180～200g。動物實驗方案考慮了實驗動物福利原則，但因FVEP檢測對動物麻醉狀態敏感，為提高準確性和可重復性采取手術眼和假手術眼在同一個體上進行實驗的策略。本研究經昆明醫科大學動物實驗倫理審查通過，本實驗操作人員具有云南省實驗動物從業資格。

1.1.2主要試劑及儀器主要試劑：一抗：Anti-Tau(phospho S396) Abcam ab109390，Anti-Tau(phospho S404) Abcam ab92676；Anti-Tau(Tau-5) Abcam ab80579；GAPDH Proteintech 10494-1-AP。二抗：Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody KPL(214-1516)；Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Antibody KPL(214-1806)。蛋白提取試劑盒：MinuteTM Total Protein Extraction Kit for Animal Cultured Cells and Tissues Catalog Number： SD-001/SN-002。蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA，100× DMSO儲液，bimake)，磷酸酶抑制劑Cocktail (100× bimake)。其他：EpiZyme科技PAGE凝膠快速制備試劑盒(10%)、義齒基托樹脂、鹽酸奧布卡因、青霉素G鉀。主要儀器設備：瑞沃德腦定位儀、瑞沃德手持鉆孔器、眼科羅蘭電生理測試儀器(德國)。

1.2方法

1.2.1動物分組及造模先將30只SD大鼠行FVEP電極植入，康復恢復1wk后隨機分成5組，每組6只，各組大鼠進行TON模型構建，左眼進行視神經夾持，右眼進行視神經暴露假手術。

1.2.1.1 FVEP模型構建(1)SD大鼠碘伏消毒腹部，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射(0.4g/kg，約0.4mL)進行麻醉，待大鼠角膜反射消失，仰臥位無法自主轉身，呼吸深慢，且用鑷子輕夾下肢腳趾無反應時即麻醉成功；(2)用動物剃毛器進行頭部備皮，碘伏消毒；(3)將大鼠固定于腦定位儀，用組織剪于顱頂正中做3～4cm切口，用彎鉗鈍性分離皮下組織，用棉簽蘸取3%雙氧水擦去顱骨表面筋膜，直至清晰辨認前后囟門；(4)撥動定位儀以前囟為起點向前3mm為陰極電極點，向后7mm后左右旁開3mm為2個陽極電極點(圖1)，用轉孔機組合0.8mm顱骨鉆頭進行顱骨打孔，用有齒鉆頭在光滑顱骨表面打磨，便于牙科義齒樹脂黏合(圖1左圖)；(5)用有齒彎鉗夾取1mm直徑的無菌不銹鋼螺絲釘分別擰入3個鉆孔，深約2mm；(6)按照1∶1比例配取牙科義齒樹脂，快速混合，用加樣槍吸取液態樹脂置于手術區域，覆蓋至手術切緣為止，待自然凝固后，取下固定中的大鼠(圖1右圖)；(7)配制200000IU/mL濃度的青霉素G鉀，每只大鼠行大腿一次性肌肉注射200μL。術后給予傷口恢復1wk，期間查看是否有感染跡象。

圖1 FVEP電極植入示意圖。

圖2 TON模型構建及視神經視網膜取材示意圖 A：TON視神經夾持示意圖，箭頭處所示為暴露的視神經；B：摘取眼球后，分離暴露的模型動物大腦；C：緩慢抬起大腦，從顱底抽出視神經，箭頭處所示為抽出的視神經；D：取出的完整視神經，箭頭處所示為左眼視神經；E：從冠狀面分離出眼球角膜、虹膜及晶狀體；F：從杯狀眼組織中鈍性分離出視網膜，箭頭處所示為分離出的完整視網膜。

1.2.1.2 TON模型構建(1)大鼠麻醉同前；(2)麻醉成功后，將大鼠取右側臥位置于手術臺上，用拇指和食指固定其頭部位置，兩指稍用力將眼瞼向兩邊提拉，左眼滴2～4滴鹽酸奧布卡因進行表面麻醉；(3)解剖顯微鏡下操作，剪開左眼外眥約2mm，環形剪開左眼球結膜，避開大血管，向后方鈍性分離眼外直肌，然后提起球結膜向前稍牽拉眼球，暴露視神經3～4mm(圖2A箭頭所示)，用夾持力為50g的視神經夾持鑷在球后約2mm處鉗夾視神經10s造成夾持損傷，注意避免損傷血管；(4)大鼠右眼為假手術眼，僅分離并暴露視神經，但不行鉗夾損傷；(5)確定造成視神經夾持損傷后，將眼球恢復原位，在眼瞼上使用紅霉素眼膏敷眼，后將大鼠放回籠中，觀察呼吸有無異常；(6)術后第2d手術眼出現Marcus-gunn瞳孔，眼球無明顯突出，檢眼鏡觀察眼底無明顯出血者為成功模型。

1.2.2 FVEP測量TON模型構建完成后，5組大鼠依次按夾持后1、3、7、14、28d進行FVEP檢測。FVEP檢測方法：(1)大鼠麻醉后置于黑箱子中進行暗適應約30min，電熱毯保持大鼠體溫；(2)檢測時，檢測眼滴入1滴復方托吡卡胺滴眼液擴瞳，對側眼不透光黑眼罩進行遮罩，連接相應電極，檢查電阻情況；(3)眼科羅蘭電生理測試儀FVEP參數設置：電極電阻低于5kΩ，頻閃強度3.0cd/(s·m2)，1Hz頻閃頻率記錄有效光刺激60次，檢測時間200ms，抽樣率5kHz，刺激響應放大2萬倍，最高和最低band-pass過濾頻率分別為1、100Hz；(4)每個眼球重復測量3次，查看FVEP檢測圖像，根據國際電生理標準(ISCEV)的標準峰型指導及既往關于大鼠FVEP檢測波型指導[24]，結合儀器自動峰型識別確定實驗大鼠FVEP的各項指標。

圖3 TON模型大鼠FVEP檢測結果 左眼：手術眼；右眼：假手術眼。

1.2.3取材FVEP檢測完成后將大鼠處死(過量2%戊巴比妥鈉2mL腹腔注射，斷頸處死)。分離頭部，去皮膚，分離左眼眶處組織，剪斷視乳頭處神經，取出眼球；從枕骨處正中分離頂骨，暴露大腦，從小腦處切斷，用鑷子緩慢抬起大腦，暴露并抽取視神經(若視神經管內發生炎性黏連，注意抽取視神經的完整性)，剪取左眼視神經(圖2B～D)。取分離的左眼球，置于盛有PBS的平板中，用眼科剪在角膜上截一孔，隨后沿冠狀面剪去角膜、虹膜及晶狀體(圖2E)，用鑷子緩慢鈍性分離視網膜(圖2F)。

1.2.4視神經/視網膜組織蛋白提取(1)按照蛋白提取試劑盒說明書進行蛋白提取，將視神經/視網膜組織放入試劑盒蛋白裂解液中，迅速依次加入蛋白酶抑制劑2μL，磷酸酶抑制劑A 2μL，混勻后加入磷酸酶抑制劑B 2μL；(2)用電動勻漿器進行冰浴勻漿，高速離心機離心14000r/min，4℃，5min；(3)吹吸過濾液，每200μL過濾液中加入100μL 3×loading buffer，10μL DTT，沸水浴10min。

1.2.5 Western blot檢測TON大鼠視神經及視網膜中Tau及pTau-Ser396/404蛋白水平(1)按快速制備試劑盒說明書配制10% PAGE凝膠；(2)上樣并電泳，90V 30min后120V 90min，電泳至溴酚藍剛跑出即可終止電泳，進行轉膜90V 90min；(3)轉膜結束后切取內參及目的條帶，于搖床PBS-Tween洗膜5×5min；5% BSA，37℃搖床封閉1h，于搖床PBS-Tween洗膜5×5min；(4)于搖床4℃過夜孵育一抗，GAPDH(1∶1000)，Anti-Tau (phospho S396)(1∶2000)，Anti-Tau(phospho S404)(1∶2000)，Anti-Tau(Tau-5)(1∶2000)；(5)次日，于搖床PBS-Tween洗膜5×5min； 二抗(1∶20000)室溫搖床孵育1h，于搖床PBS-Tween洗膜5×5min；ECL化學發光試劑顯影。蛋白樣本檢測進行獨立3次重復實驗。運用Image J軟件進行灰度掃描，經內參校準后進行蛋白表達差異分析。

2結果

2.1 TON大鼠FVEP電生理信號變化通過觀察大鼠FVEP電生理圖譜發現，各組大鼠3次重復測量均一性較好，其中尤以N2-P2峰識別性較高，故本研究統計分析圍繞N2波潛伏期和N2-P2波振幅進行，其他指標不予分析。檢測結果發現，TON模型大鼠假手術眼出現了典型的FVEP波形，表明僅暴露右眼視神經并不會對FVEP的各項指標產生嚴重影響(圖3)；相較于假手術眼，手術眼各檢測時間點FVEP的N2波均發生顯著延遲，平均延遲時間為14.98ms，FVEP的N2-P2波振幅均發生顯著縮減，平均縮減42.85μV(表1，圖4)，且手術眼在檢測時間范圍內(1～28d)均無法恢復至對側假手術眼視覺水平。此外，TON大鼠雙眼N2-P2波振幅相對值和N2波潛伏期相對值在各時間點上總體均不存在顯著差異(F=1.023，P=0.400；F=1.619，P=0.176)，但N2波潛伏期相對值在3～7d延遲幅度明顯降低(圖5)。以上結果表明大鼠視神經受到外傷性損傷之后視覺障礙加劇，7d時機體可能發生了N2波潛伏期改善，提示大鼠視神經脫髓鞘可能有所緩解。

2.2 TON大鼠視網膜Tau及其磷酸化變化TON大鼠視網膜Tau及其磷酸化位點Western blot檢測泳道內可檢測到多個條帶(與標準蛋白marker比對，其陽性條帶大小約為45、55～70、120kDa)，均為Tau不同單體型，其中55～70kDa可見緊密重疊的兩條主要Tau單體型，故本研究圍繞此附近條帶進行分析(圖6)。結果顯示，夾持損傷后視網膜總Tau含量顯著降低(F=8.808，P=0.001)，其中1d內變化不明顯，隨后急劇下降，3d時達低谷，7d時存在一定量的恢復隨后繼續下降，直至28d穩定至略低于正常水平；pTau-Ser396/404的含量與總Tau的變化一致，均顯著降低(F=5.901，P=0.006；F=16.543，P<0.001)，但pTau-Ser396/404與總Tau含量的相對比率變化則不同，Ser 396位點在夾持損傷后的磷酸化比率更高(F=11.999，P<0.001)，而Ser 404位點的相對磷酸化水平則降低(F=8.970，P<0.001)，表明夾持損傷后視網膜中Tau的Ser 396位點較Ser 404位點更易發生磷酸化。

圖4 TON后不同時間點手術眼與假手術眼FVEP檢測結果比較 A：N2波潛伏期；B：N2-P2波振幅。bP<0.01 vs假手術眼。

圖5 TON后不同時間點手術眼相較于假手術眼N2波潛伏期延遲和N2-P2波振幅縮減情況 A：N2波潛伏期相對值；B：N2-P2波振幅相對值。

表1 TON后不同時間點手術眼與假手術眼FVEP檢測結果分析

2.3 TON大鼠視神經Tau及其磷酸化變化TON大鼠視神經Tau及其磷酸化位點Western blot檢測較視網膜更難以檢測，但條帶位置與視網膜結果所示位置一致(圖7)。結果顯示，夾持損傷后視神經中總Tau含量呈增多趨勢(F=9.469，P=0.001)，14d時達最高值，直至28d仍處于一種略高于正常水平的狀態；pTau-Ser396/404的變化與總Tau的變化大致相同，其中pTau-Ser396表達呈增多趨勢(F=6.176，P=0.005)，而pTau-Ser404表達明顯增加(F=12.419，P<0.001)，7d時增長并抵達高峰隨后回落至高于正常水平值；pTau-Ser396/404與總Tau含量的相對比率分析顯示，Ser 396位點相對磷酸化程度降低(F=37.173，P<0.001)，而Ser 404位點7d時表現出相對磷酸化程度增高的現象(F=15.088，P<0.001)。

3討論

本研究探討了FVEP技術檢測大鼠TON后視覺障礙的變化情況，識別度較高的N2及P2相關指標可用于監測大鼠視覺功能水平。FVEP檢測結果表明TON后大鼠FVEP波形明顯紊亂，視覺功能發生嚴重障礙，且隨著檢測時間的持續，該障礙的狀態沒有發生逆轉，說明TON模型構建對大鼠視覺功能的影響是不能短期自愈的。FVEP檢測結果中，TON后7d時，模型鼠的視覺功能發生了小幅度且短暫的改善現象，分析可能是視神經與視網膜中膠質細胞活化清除受損細胞和部分修復受損軸突脫髓鞘所致[25]。值得注意的是，上述改善未能獲得很好的統計學支持，說明改善程度輕微或分組內個體不足導致了檢驗效能不足，今后進行FVEP檢測大鼠TON視覺通路變化情況需要增大分組內個體數目。盡管如此，這種短暫改善并沒有持續發生和進一步增強，表明在缺乏外界干預的情況下，TON大鼠視神經的自發修復有限，可能存在完整功能的神經元發生了進一步凋亡的現象[26]。

圖6 TON后不同時間點大鼠手術眼視網膜Tau及其磷酸化蛋白相對表達情況 對照組：大鼠視神經夾持損傷后1d右眼(假手術眼)視網膜組織。A：視網膜總Tau含量相對于對照組的變化情況；B：視網膜Tau磷酸化位點Ser 396含量相對于對照組的變化情況；C：視網膜Tau磷酸化位點Ser 404含量相對于對照組的變化情況；D：視網膜總Tau、Tau磷酸化位點Ser 396及Tau磷酸化位點Ser 404的蛋白電泳圖；E：視網膜Tau磷酸化位點Ser 396含量與總Tau含量比值相對于對照組的變化情況；F：視網膜Tau磷酸化位點Ser 404含量與總Tau含量比值相對于對照組的變化情況。aP<0.05，bP<0.01 vs 對照組；cP<0.05，dP<0.01 vs 夾持損傷后1d；eP<0.05 vs 夾持損傷后3d。

圖7 TON后不同時間點大鼠手術眼視神經Tau及其磷酸化蛋白相對表達情況 對照組：大鼠視神經夾持損傷后1d右眼(假手術眼)視神經組織。A：視神經總Tau含量相對于對照組的變化情況；B：視神經Tau磷酸化位點Ser 396含量相對于對照組的變化情況；C：視神經Tau磷酸化位點Ser 404含量相對于對照組的變化情況；D：視神經總Tau、Tau磷酸化位點Ser 396及Tau磷酸化位點Ser 404的蛋白電泳圖；E：視神經Tau磷酸化位點Ser 396含量與總Tau含量比值相對于對照組的變化情況；F：視神經Tau磷酸化位點Ser 404含量與總Tau含量比值相對于對照組的變化情況。aP<0.05，bP<0.01 vs 對照組；cP<0.05，dP<0.01 vs 夾持損傷后1d；eP<0.05，fP<0.01 vs 夾持損傷后3d；gP<0.05，hP<0.01 vs 夾持損傷后7d；jP<0.01 vs 夾持損傷后14d。

大鼠TON后，1～3d時視網膜中總Tau的含量急劇降低，這表明在神經元受損的早期，視網膜中的神經元胞體死亡或受到干擾難以合成足量的Tau進行微管穩定，存量的Tau逐漸被消耗，這與高眼壓青光眼模型中的Tau聚集在視網膜RGC胞體內的情況不同[22]。TON后7d時視網膜Tau產生了一定量恢復，說明部分RGC已經恢復功能開始正常合成Tau，這與FVEP中觀測到的7d改善現象一致。與視網膜中總Tau含量變化不同的是，視神經總Tau的含量卻是逐漸增加的，其可能的原因是破損的軸突中多聚化Tau的清除機制降低，殘留多聚化Tau與眼球近端軸突轉運來的大量Tau在損傷處形成神經纖維纏結[27]。此外，受損軸突中伴隨著Tau增多，兩個檢測位點的磷酸化水平也隨之增高。有研究表明，在人類阿爾茨海默病患者的外周血中，Tau的Ser396/404過度磷酸化是潛在的疾病診斷指標之一，因此TON后視神經中pTau-Ser396/404的增加可能對視神經的修復起到抑制作用[28]。此外，TON后視網膜和視神經軸突中pTau-Ser396和404兩個磷酸化位點發揮作用的程度也不同，在視網膜中主要的磷酸化增量位點為Ser 396，而在視神經中的增量磷酸化位點為Ser 404，其原因可能是兩個磷酸化位點對Tau功能影響存在差異；另一種可能是磷酸化次序因素，Ser 396位點磷酸化后404位點才進一步磷酸化。

總的來說，FVEP技術可在活體狀態下對模型動物的視覺通路功能進行無創檢測，這是研究某些視網膜或視神經相關疾病損傷的優良終點指標，但是該技術對研究者電極植入和FVEP波形的識別有一定的要求，且不同實驗項目對分組動物個體數目的要求也會不同。近年來研究者對神經退行性疾病中Tau和Tau磷酸化等相關指標的興趣倍增，本研究表明異常的Tau聚集和Tau過度磷酸化是TON后疾病發生發展的重要因素，探索Tau與TON發展的分子機制和研究視神經微管穩定與TON的關系是今后開展治療視神經損傷的堅實基礎。