淺談高效液相色譜法分析條件的選擇及在檢驗領域的應用與發展

（石家莊醫學高等專科學校 河北 050000）

高效液相色譜法（HPLC）是在經典液相色譜的基礎上引入氣相色譜法的塔板理論和速率理論，逐步發展起來的一種分離分析方法。高效液相色譜法最大的優勢是分離混合物中各種組分，相較于經典液相色譜法，HPLC中加入了高壓泵，而且固定相顆粒比經典液相色譜法固定相顆粒直徑要小且均勻，從而提高了分離分析的速度，通常分離分析僅需要幾分鐘到幾十分鐘。相較于氣相色譜法來說，高效液相色譜法可用于熱不穩定物質的分離分析。由于分離分析速度快，分離效果好等優點，在農業、醫學、工業、檢驗等各領域，高效液相色譜法都有著十分廣泛的應用。

1.高效液相色譜法測定條件的選擇

HPLC在分離混合物時，如何選擇色譜條件，決定著分離效果。HPLC色譜分離條件的選擇主要以塔板理論和速率理論作為指導，包括色譜柱規格的選擇、固定相和流動相的選擇、柱溫的控制、流動相流速控制等。

(1)色譜柱規格的選擇

色譜柱規格主要包括柱長，柱內徑以及固定相顆粒直徑。

高效液相色譜柱柱內徑的規格有2.1mm、3mm、4.6mm等，但目前最常用的是4.6mm。其它條件相同情況下，色譜柱內徑越大，能分離樣品的量越大，得到的峰形越好，對高效液相色譜儀器中的死體積敏感性越低，柱效相對也會高一些，但內徑越大，在相同流速下，會消耗更多的溶劑。

綜上所述，在色譜柱規格選擇上，要進行綜合考量。

(2)固定相和流動相的選擇

固定相和流動相選擇合理，才能使混合物中各組分得到較好的分離效果。

①固定相的選擇

在液-固色譜法中，現在應用最廣泛的固定相有硅膠、活性炭等，硅膠同時還可用于液-液分配色譜法中的載體和鍵合相色譜中的基體。近年來，鍵合相色譜法應用較多，因為這種方法可減少固定液的流失，分離效果好，適用范圍廣。弱極性脂溶性成分一般用正相鍵合相色譜，而弱極性、中等極性和較強極性的物質一般采用反相鍵合相色譜，可見反相鍵合相色譜應用范圍更廣一些。在反相鍵合相色譜中固定相常用的是C18，即把十八個碳原子的烷烴通過反應鍵合到硅膠上，固定相顆粒分為全多孔型和表面多孔型（薄殼型微珠）。相對分子量超過2000的高分子化合物如蛋白質、核酸和聚合物等可以采用凝膠色譜法，在這種方法中，應用最多的固定相是葡聚糖凝膠。當被分離的物質為離子或者可解離的化合物，可以采用離子交換色譜法，這種方法的固定相普遍使用的是鍵合型離子交換劑。

②流動相的選擇

高效液相色譜法流動相可以是一種溶劑組成，也可以是兩種或兩種以上溶劑組成。常見流動相有水、甲醇、乙腈、四氫呋喃，這幾種溶劑為極性溶劑，常用于反相色譜中。在正相色譜中，普遍使用的流動相有正己烷、乙醚、乙酸乙酯等。在實際應用中，常常把幾種溶劑按照合適的比例混合在一起，溶劑成分和比例不同，極性也不同，對被測物的溶解能力不同，分離的效果自然也會不同，出峰時間也會相應發生變化。流動相對于被分離的物質必須要有合適的極性和選擇性。

反相色譜中，流動相的pH值影響組分的保留時間，同時也會影響色譜峰的峰形以及分離度。分離弱酸性樣品時，常加入少量的弱酸，抑制樣品的解離，反之分離弱堿性樣品時，常加入少量的弱堿，抑制弱堿樣品的解離，以獲得良好的峰形。

(3)柱溫的控制

高效液相色譜法中，一般情況下，提高柱溫，可以影響分離度，降低保留時間，提高柱效，增大樣品的溶解度，使得色譜峰更加對稱，但過高的柱溫會使得流動相產生氣泡。柱溫的控制要根據樣品組分的性質而定，如對于黏度大或高分子化合物，設置柱溫時要高于室溫，對于具有生物活性的生物分子，溫度過高會使其失去生物活性，所以柱溫要設置為低于室溫。

(4)流動相流速控制

根據范第姆特方程，流動相的流速會對色譜柱的柱效和組分的保留時間有一定的影響，在一定范圍內，流速越大，柱效會提高，分析時間會縮短，但超過某一流速值，柱效就會降低，這個流速值稱為最佳流速。其它條件相同的前提下，色譜柱內徑不同，設定的流速也應當不同，比如當內徑是4.6mm時，通常將流速設定為1mL/min。

(5)檢測器的選擇

高效液相色譜法的檢測器分為示差折光檢測器、紫外吸收檢測器、光電二極管陣列檢測器、熒光檢測器、蒸發光散射檢測器等。不同的檢測器都有相應的優勢和缺陷，要根據被測物的種類、被測物含量以及流動相對測定是否有影響等因素，選擇合適檢測器。

如光電二極管陣列檢測器可以全波段掃描，能得到三維立體圖譜，而紫外吸收檢測器只能用設定的波長對被分離后的組分進行掃描。示差折光檢測器常用于萜類化合物、多糖類化合物含量的測定，但不能采用梯度洗脫。熒光檢測器適用于能顯示熒光的被測物含量檢測，常用于生化分析和藥物分析中，這種檢測器的靈敏度很高，痕量組分檢測就可以考慮選擇熒光檢測器，如PM2.5中苯并[a]芘含量的測定。

2.高效液相色譜法在檢驗領域中的應用與發展

高效液相色譜法廣泛應用于藥物檢驗、食品檢驗、生物化學檢驗、臨床檢驗等領域，例如通過檢驗生物體內的多肽和蛋白質含量，可分析出生物體內的多肽和蛋白質的變化情況。食品檢驗中可以檢測防腐劑、黃曲霉素、瘦肉精等含量。臨床檢驗中，高效液相色譜法可以檢測體內氨基酸、膽汁酸、核酸、多種同工酶。

高效液相色譜法最大優勢在于分離混合物中物理性質和化學性質相近的組分。但高效液相色譜法在定性分析和定量分析中有一定局限性，比如要有參照物或者標準樣品，用紫外吸收檢測器在最大波長處可能會受干擾，靈敏度低等因素，所以高效液相色譜法經常與其它檢驗方法一起使用，比如質譜法。用高效液相色譜法對混合物進行分離，分離后各組分的含量用質譜法進行分析測定，質譜法靈敏度高，檢測下限低，而且能夠提供相對分子量和結構等信息，充分發揮了兩種測定方法的優勢，是近幾年來被廣泛應用的一種分析方法。

3.小結

綜上所述，在采用高效液相色譜法時，為保證良好的分離效果，需要通過綜合考量和實驗驗證，最終確定最優的測定條件。由于高效液相色譜法在定性分析和定量分析的限制性，高效液相色譜法常常與質譜法聯合應用，從而擴大了檢測范圍。今后，高效液相色譜法還可以通過與其它檢驗方法的聯合使用，進一步擴大檢測范圍，在檢驗領域發揮更大的作用。