17β-雌二醇注射雌性金錢魚下丘腦轉錄組分析

石紅娟，茹笑影，劉玉琪，鄭 蕓，伍旭輝，黃 洋，李廣麗，江東能

（1.廣東海洋大學水產學院//2.廣東省名特優魚類生殖調控與繁育工程技術研究中心，廣東 湛江 524088；3.金湖縣人民醫院，江蘇 淮安 211600）

下丘腦是調節機體和內分泌活動的重要神經中樞，也是神經內分泌的重要樞紐。作為一個重要的內分泌器官，下丘腦直接分泌多種神經內分泌激素，調控垂體中激素的分泌及其靶腺的活動，包括體溫控制、睡眠、生理節律、生殖和生長等[1-3]。性類固醇激素雌激素在動物的生殖和生長發育過程中扮演重要的角色。在哺乳類，雌激素參與調控雌性卵巢生殖細胞囊破裂和初級濾泡形成[4]。在鳥類、爬行類、兩棲類和魚類等低等脊椎動物，雌激素是參與性別決定與分化的重要因子[5-9]。此外，雌激素還參與調控機體生長激素（Growth hormone，GH）的合成與分泌。在人類，雌激素17β-雌二醇（17β-Estradiol，E2）能顯著上調垂體中生長激素GH的分泌[10]。在魚類，雌激素也能調控垂體中GH的合成和分泌[11-13]。在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、馬蘇大馬哈魚（Oncorhynchus masou）和黑頭軟口鰷（Pimephales promelas）和金錢魚（Scatophagus argus）中，高濃度雌激素E2或17α-乙炔雌二醇（17α-Ethinylestradiol，EE2）處理顯著上調雌魚垂體中ghmRNA表達[12-14]。研究發現，腹腔注射E2能顯著上調金錢魚垂體中ghmRNA的表達[15]，但在體注射雌激素對下丘腦中基因表達的影響研究尚未見報道。

金錢魚隸屬于鱸形目（Perciformes）金錢魚屬（Scatophagus），主要分布在太平洋和印度洋，是我國東南沿海地區重要的經濟品種。金錢魚肉質鮮嫩，富含多種的營養物質，可為人體提供多種不飽和脂肪酸[14-18]。此外，金錢魚個體適中、性成熟年齡短，具有明顯的雌、雄生長二態性，雌魚快于雄魚。與此相一致，金錢魚生長激素gh呈二態性表達，雌魚垂體中gh表達顯著高于雄魚[13]。在金錢魚人工養殖過程中，雌、雄魚性腺發育不同步，雌魚卵泡不能充分發育成熟，需要施加適量催產素進行催產。因此，本研究通過開展轉錄組測序分析雌激素在體注射后對雌性金錢魚下丘腦中基因表達的影響，以期為金錢魚生長二態性和卵泡發育的機制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗所用的12尾2齡雌性金錢魚均購于廣東省珠海市育成魚苗養殖有限公司，在廣東海洋大學東海島生物研究基地養殖。

1.2 活體注射外源雌激素

將雌性金錢魚隨機分為兩組：對照組和E2（Sigma-Aldrich，美國）注射組。其中E2組金錢魚腹腔注射4.0 g/L的E2乙醇溶液，每克體質量注射1 μL，對照組雌魚注射等劑量無水乙醇。6 h后麻醉解剖，取下丘腦樣品，液氮速凍，操作結束后轉移至-80 ℃保存，用于提取下丘腦總RNA、進行轉錄組測序等后續實驗。

1.3 提取總RNA

按照Trizol試劑盒（Invitrogen，美國）說明 書[14]提取雌魚下丘腦總RNA。取1 μL總RNA用于質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，另取1 μL總RNA，利用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白測定儀（Thermo Scientific，美國），測定濃度和質量，其余總RNA置于-80 ℃保存，備用。

1.4 RNA樣品檢測、文庫構建及測序

RNA樣品的純度、濃度和完整性檢測合格后，構建文庫，具體流程如下：1）按照VAHTS?mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina試劑盒（諾唯贊，中國）說明書，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；2）加入Fragmentation緩沖液將mRNA進行隨機打斷；3）以mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶I合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA；4）純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進行片段大小選擇；5）最后通過PCR富集得到cDNA文庫。然后，分別使用Qubit 2.0和Agilent 2100對文庫的濃度和插入片段大小（Insert Size）進行檢測，使用qPCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。待庫檢合格后，用HiSeq X-ten進行高通量測序，測序讀長為PE150。

1.5 差異表達基因篩選

HiSeq X-ten高通量測序平臺對cDNA文庫進行測序，獲得以FASTQ格式存儲的Raw Data，通過測序質量控制得到了Clean Data。然后，使用HISAT2比對系統將每個文庫中的Clean reads與金錢魚參考基因組（數據尚未公布，基因組大小為572.42 Mb，Contig N50 19.60 Mb，預測到24 256個基因）進行比對及后續的分析。利用RPKM（the reads per kb per million reads）法[19]計算每個基因在不同樣本中的表達量。測序差異基因的檢測方法，參照文獻[20]對金錢魚E2注射組和對照組進行差異表達分析。使用錯誤發現率（False Discovery Rate，FDR）來調整所得的P值的閾值，將|log2(FC)|≥1且FDR≤0.05作為差異表達基因檢測過程中的篩選標準。其中對照組金錢魚下丘腦轉錄組中RPKM≤1的基因，都歸為本底表達基因（background expression），不再進行后續分析；RPKM＞1，-1＜log2(FC)＜1且FDR＞0.05的基因歸為無差異表達基因（nondifferentially expressed genes）；而RPKM＞1，|log2(FC)|≥1且FDR≤0.05的基因歸為上調（up-regulated）/下調（down-regulated）表達基因。

1.6 差異表達基因功能注釋和通路富集分析

將篩選獲得的差異基因，通過百邁客在線云平臺（http://www.biocloud.net/），在線對差異表達基因進行MA圖、火山圖、GO功能注釋和KEGG通路富集分析。

1.7 實時熒光定量PCR（Real-time quantity PCR，qPCR）驗證差異表達基因

此實驗所用的所有引物見表1。利用Primer 5.0設計差異基因prl、pgr特異的熒光定量引物，cyp19a1b、3β-HSDI和生長相關基因ghrh、sst1、sst3、sst5、sst6的引物序列參照[14-15,18]。采用qPCR檢測雌性金錢魚下丘腦中差異基因的表達。qPCR反應在實時熒光定量PCR儀（Roche，瑞士）上進行，根據試劑盒說明書進行：反應體系及程序設定參照文獻[15]。β-actin為內參基因。運用2-ΔΔCt方法計算差異基因的相對表達量。數據表示為平均值±標準差（means±SD），6個生物學重復。采用SPSS 18.0進行單因素方差分析和Duncan多重比較，檢驗的顯著性概率臨界值為0.05。

2 結果與分析

2.1 下丘腦轉錄組測序質量評估

金錢魚下丘腦轉錄組測序結果顯示，總共獲得Raw bases數目為57 019 996 730，高質量純凈序列Clean reads為190 909 756。測序質量統計結果表明，測序的質量值20（Q20）百分比均超過98%，質量值30（Q30）百分比均超過94%，GC含量所占比例在47.93%～48.38%（表2）。測序質量總體較好，可進行后續研究分析。

2.2 E2處理雌性金錢魚下丘腦轉錄組分析

基因注釋的結果顯示，基于NR、Swissprot、KOG、KEGG和GO等 6個數據庫，通過基因序列比對，共注釋到金錢魚下丘腦中17 687個基因，采用 EBSeq 軟件分析獲得對照組、E2注射組的差異表達基因集（RPKM＞1，|log2(FC)|≥1和FDR≤0.05），結果顯示篩選到22個差異表達基因，包括11個表達上調基因，11個表達下調基因，將篩選出來的差異表達基因繪制MA圖及火山圖（圖1 A、B）。

圖1 差異基因表達情況Fig.1 Differences of genes expression

2.3 E2注射雌性金錢魚下丘腦中差異表達基因的篩選

基于E2注射組和對照組雌魚下丘腦中基因RKPM值變化倍數，篩選到22個差異表達基因：prl（催乳素）、erf3α（真核肽鏈釋放因子3α）、pde6h（磷酸二酯酶6H，cGMP特異，視錐，γ）、pgr（孕激素核受體）、lingo3（富含亮氨酸重復序列和免疫球蛋白結構域的與Nogo受體相互作用蛋白3）、zbtb4（鋅指與btb結構域蛋白4）、cyp19a1b（細胞色素p450家族19亞家族a多肽1b）、nlrc3（核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3）、3β-HSD I（3β-羥類固醇脫氫酶Ⅰ）、arntl（芳香烴受體核轉位蛋白）、pcdhαc2（原鈣黏蛋白α-c2）、chsy1（硫酸軟骨素合酶）、muc17l（黏蛋白17樣蛋白）、prf1（穿孔素1）、hla-α（MhcⅠ類抗原）、nlrp12（Nacht富亮氨酸重復序列和Pyd結構域）、kcnt1（Na＋激活K＋通道）、tprg1l（腫瘤蛋白p63調節類因子1）、ifi44l（干擾素誘導蛋白44樣蛋白）、cntn3（接觸蛋白3）、scocob（短卷曲螺旋蛋白）和1個尚未注釋基因（表3）。

表3 篩選差異表達基因Table 3 Filter differentially expressed genes

2.4 E2注射雌性金錢魚下丘腦中差異表達基因功能富集分析

基因GO功能富集分析結果顯示，涉及生物學過程、細胞組分和分子功能這3大功能分類中54個功能小類。其中，差異基因涉及的生物過程有8個，包括細胞過程、代謝過程、發育過程等；細胞組分6個，包括細胞、細胞組分、膜組分等；分子功能2個，包括結合、催化活性等（圖2）。

圖2 差異表達基因的GO功能富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of differential expression genes

圖3 差異表達基因的KEGG功能富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of differential expression genes

進一步通過KEGG系統分析差異基因涉及的代謝途徑結果（圖3）顯示，E2處理雌性金錢魚下 丘腦轉錄組中的差異表達基因參與生物系統、人類疾病、環境信息處理、代謝、細胞過程和遺傳遺傳信息處理6大類，孕激素介導的卵母細胞成熟、單純皰疹感染、細胞黏附分子、嘌呤代謝等13小類代謝通路。

2.5 E2對金錢魚下丘腦中性類固醇激素和生長相關基因表達的影響

與下丘腦轉錄組結果相一致，qPCR結果顯示，與對照雌魚相比，E2注射組雌魚下丘腦中prl、pgr、cyp19a1b和3β-HSDI的表達顯著上調（圖4）。

下丘腦轉錄組（圖5 A）和qPCR（圖5 B）結果顯示，與對照雌魚相比，E2注射組雌魚下丘腦中，生長相關基因ghrh、sst1、sst3、sst5和sst6的表達無顯著差異（P＞ 0.05）。

圖4 雌魚下丘腦中類固醇激素合成相關基因的表達Fig.4 Steroid genesis related genes expression in hypothalamus of female fish

圖5 雌魚下丘腦中類固醇激素合成相關基因的表達Fig.5 Steroid genesis related genes expression in hypothalamus of female fish

3 討論

雌激素在魚類、兩棲類、爬行類等低等脊椎動物的性別決定、性別分化過程中具有重要作用，同時也參與脊椎動物卵泡發育過程。此外，在生殖軸（下丘腦―垂體―性腺軸）中，雌激素通過反饋作用調節下丘腦的生理機能。在本研究中，E2在體注射雌性金錢魚后，通過下丘腦轉錄組篩選到22個差異基因，包括prl、erf3α、pgr和cyp19a1b等11個表達上調基因和chsy1、muc17l、prf1和hla-α等11個表達下調基因，共涉及孕激素介導的卵母細胞成熟、類固醇激素生物合成、單純皰疹感染、細胞黏附分子和嘌呤代謝等13個信號通路。

3.1 E2在體注射后對下丘腦中生殖相關基因表達的影響

在本研究篩選與鑒定的22個差異基因中，篩選到3個生殖相關信號通路基因：孕激素介導的卵母細胞減數分裂和卵泡成熟通路（pgr）、類固醇激素生物合成通路（cyp19a1b、3β-HSDI）。其中，孕激素受體Pgr介導孕激素在卵泡成熟和排卵過程中發揮重要功能，其表達主要受特異配體孕激素的調控。本研究qPCR和轉錄組結果表明，在魚體注射E2能顯著上調雌魚下丘腦中pgrmRNA的表達。在金頭鯛（Sparus aurata）中，研究發現E2能顯著上調pgr的轉錄與表達[21-22]。因此，雌激素E2也可通過反饋作用激活下丘腦-垂體中pgr的表達。此外，本研究中E2在魚體注射后，腦型芳香化酶基因cyp19a1b在下丘腦中的表達顯著上調。同樣，在其他硬骨魚類中，研究發現E2能顯著上調cyp19a1b的表達[23-26]，其通過雌激素受體結合在cyp19a1b基因啟動子的雌激素效應元件（estrogen response element，ERE）來激活cyp19a1b的轉錄[27-30]。同時，E2在魚體注射后，下丘腦中性類固醇激素合成通路關鍵酶基因3β-HSDI的表達顯著上調。這些結果表明，E2可通過反饋作用調節下丘腦中生殖相關基因的表達。

3.2 E2在體注射后對下丘腦中生長相關基因表達的影響

性類固醇激素，尤其是雌激素參與調控生長激素（GH）的分泌和合成。在金錢魚中，前人研究發現，E2在魚體注射6 h后，雌魚垂體中生長激素ghmRNA的表達顯著上調，肝臟中ghr1和igf1mRNA的表達顯著下調，而下丘腦中ghrh表達未受影響[14-15,31]。垂體中生長激素gh的表達受到下丘腦中生長激素釋放激素Ghrh和生長抑素Ss的調控。本研究中轉錄組和qPCR結果顯示，E2在魚體注射6 h后，下丘腦中生長激素釋放激素ghrh和生長抑素sst1、sst3、sst5和sst6mRNA表達未受到影響。這表明E2可能在垂體和肝臟水平直接或間接地調控垂體中gh的表達，而非通過下丘腦水平。小鼠垂體細胞系GH3和MtT/S中的研究發現，雌激素能顯著上調細胞系中GHmRNA的表達。同樣，在雌激素受體ERα敲除小鼠中，垂體中GHmRNA表達水平顯著降低，通過施加E2顯著上調了GH的表達，這表明，E2可直接調控垂體中GH的表達和GH分泌[32]。此外，E2通過下調小鼠肝臟中GHR的表達減弱肝臟對生長激素的敏感度，從而下調肝臟中IGF1的表達，進而通過IGF1的負反饋作用間接上調垂體中GH的表達[10,33]。因此，E2還可在肝臟水平間接調控垂體中GH合成。在金錢魚中，E2在魚體注射6 h后，雌、雄魚垂體中生長激素ghmRNA的表達顯著上調，而肝臟中ghr1和igf1 mRNA的表達顯著下調[15,31]。在歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）、尼羅羅非魚、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、馬蘇大馬哈魚（Oncorhynchus masou）和黑頭軟口鰷（Pimephales promelas）中，高濃度雌激素E2或 EE2處理顯著上調垂體中ghmRNA表 達[34-37]，而肝臟中ghr1、ghr2和igf1mRNA的表達顯著下調[11,38]。因此，和哺乳類一樣，一方面，雌激素可在直接在垂體水平調控魚類gh的表達；另一方面，雌激素通過降低肝臟中生長激素受體ghr表達降低其對GH的敏感度，同時下調肝臟中胰島素生長因子igf1的表達，通過其負反饋作用間接調控垂體中gh的表達。

4 結論

E2注射后激活了金錢魚下丘腦中生殖通路基因如pgr、cyp19a1b和3β-HSDI的表達，但下丘腦中生長軸相關基因生長激素釋放激素基因ghrh和生長抑素基因sst表達未受到影響。E2主要通過在垂體和肝臟水平調節gh的表達，而非下丘腦水平。這對雌激素調控金錢魚垂體gh二態性表達的分子機制研究具有重要的參考價值。