波吉卵囊藻胞外濾液對銅綠微囊藻轉錄水平的影響

王孝謙，黃翔鵠，李長玲，羅國玲，張 寧，王新宇，張玉蕾

（1.廣東海洋大學水產學院//2.廣東省藻類養殖及應用工程技術研究中心，廣東 湛江 524088）

目前，地表水多面臨水體富營養的環境問題[1]，水體浮游藻類營養過量，有害微藻暴發增長，形成有害藻華，危及水生動物、植物乃至人類健康[2-4]。銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）是一種常見的水華藍藻，它形成藻華頻率快，破壞力巨大[5]。有害藻華防控方法已成為研究熱點。黏土法是目前常用物理學方法，主要通過黏土顆粒黏連藻體形成絮團沉降，但該方法耗費巨大且會影響底棲生物生長[6]；化學方法中，水體稀釋消耗的試劑量巨大及化學試劑殘留，對生態環境造成二次破壞；生物法主要利用生物間的競爭作用，控制有害藻生長。有些微藻可通過化感作用干擾其他微藻生長，獲得競爭優 勢[7]。大部分化感物質可天然合成并可自我降解，對環境的二次污染小[8]。因此，利用生物法防控藍藻水華，投入人力財力較少，且生態環境友好[9]。

波吉卵囊藻（Oocystis borgei）是對蝦高位池常見的優勢綠藻，所形成的優勢群落可維持40～50 d，有利于水體穩定[10]。其對復雜的養殖環境有極強的適應性[11-13]，還可吸收水體的氨氮[14-15]，對弧菌也有一定抑制效果[16]。有研究報道，可用波吉卵囊藻控制蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的生長速度，防止小球藻生長過快破壞水體生態平衡[17]。波吉卵囊藻胞外濾液可破壞銅綠微囊藻細胞膜，有效抑制銅綠微囊藻生長，但具體機制尚未明確[18]。應用波吉卵囊藻防控藍藻有巨大潛力[19]。

轉錄組指細胞或組織在特定情況下所表達的所有RNA，可反映基因表達情況及生物代謝途徑變化[20]。轉錄組學技術可快速篩選出植物應對脅迫的相關因子，反映能量代謝、信號傳導等生物學途徑和抗逆應激的關系，對了解有毒物質與細胞間作用機制，探究細胞對不良環境的免疫耐受機制有重要意義[20-23]。Zhao等[24]通過轉錄組技術發現，在高氨氮脅迫下，亞心型扁藻（Platymonas subcordiformis）受到氧化損壞，而添加植物激素可使其抗氧化、解毒能力加強。Du等[25]發現，在C60集聚體處理一周后，柵藻（Scenedesmus obliquus）與三羧酸循環相關的基因表達量顯著變化，推斷是循環產物蔗糖的積累導致其光合能力損傷。為進一步探索波吉卵囊藻胞外濾液對銅綠微囊藻的抑制機制，本研究通過高通量測序技術對在波吉卵囊藻胞外濾液中培養的銅綠微囊藻進行測序，分析波吉卵囊藻對銅綠微囊藻的化感作用，為藍藻防控研究及藍藻應對逆境脅迫的分子機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

波吉卵囊藻由廣東海洋大學藻類資源開發與養殖環境生態修復實驗室提供，所用培養基為BG11培養基[26]，初始密度1×106mL-1，培養條件：溫度（25±1）℃，照度3 500 lx，光/暗周期12 h/12 h。每天搖勻3次，防止微藻掛壁和沉降。培養10 d后，收集上清液，依次用孔徑0.45、0.22 μm的濾膜過濾，獲得波吉卵囊藻的胞外濾液。經測定，波吉卵囊藻濾液的總氮、總磷濃度與BG11培養基相差較小，按照BG11培養基配方補齊氮、磷營養鹽，可滿足銅綠微囊藻正常生長所需。

銅綠微囊藻（FACHB-905）購自科院水生淡水藻種庫。分別使用BG11培養基（對照）和波吉卵囊胞外濾液培養銅綠微囊藻，初始密度為1×106mL-1，設置3組生物學重復，培養條件同上。胞外濾液培養下的銅綠微囊藻記為OB1、OB2、OB3組，BG11培養下的銅綠微囊藻記為C1、C2、C3組。培養4 d后，對照組密度為3.14×106mL-1，實驗組密度為0.971×106mL-1，生長差異顯著（P＜ 0.05），實驗組生長受到抑制。離心收集藻細胞，用液氮速凍，儲存于-80 ℃超低溫冰箱，用于轉錄組測序。

1.2 RNA提取及cDNA文庫構建與測序

使用天根RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取冷凍藻細胞總RNA，操作過程嚴格按照說明書進行。采用Nanodrop檢測提取樣品質量，RNA專用瓊脂糖電泳檢測樣品完整性。將質檢合格的樣品進行轉錄組文庫構建，采用第2代測序技術，基于Illumina測序平臺，對轉錄組文庫進行雙末端測序。轉錄組文庫構建和高通量測序均委托上海派森諾科技股份有限公司進行。

1.3 轉錄組數據分析

用Cutadapt軟件對測序后的原始數據進行低質量及接頭過濾。通過Bowtie2（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）建立參考基因組索引，將過濾后Reads與參考基因組（GCF_002095975.1_ ASM209597v1_genomic.fna）進行比對。使用HTSeq 0.6.1p2 (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq) 進行基因表達的定量分析。

1.4 差異表達基因分析

通過DESeq（Version 1.18.0）對基因表達進行差異性分析。log2(差異倍數) ＞ 1時，基因表達上調，log2(差異倍數) ＜ 1時表達下調。將log2|差異倍數| ＞ 1、P＜ 0.05的基因作為表達差異顯著基因。使用topGO進行GO富集分析（P＜ 0.05時，顯著富集），確定差異基因的主要生物學功能。統計各KEGG通路不同層級上包含的差異表達基因數目，進而確定差異表達基因主要參與的代謝途徑和信號通路，以整個基因組為背景，采用超幾何分布計算差異基因顯著富集的通路。

1.5 實時熒光定量PCR驗證

為檢驗測序結果的準確性，選取14個表達差異顯著的基因，設計相應引物（表1），以銅綠微囊藻16S rRNA基因（GenBank ID:U03402.1）作為內參，進行實時熒光定量PCR驗證（qRT-PCR驗證）。實驗過程嚴格按照TransStart?Tip Green qPCR SuperMix說明書進行。每組樣品重復3次，以2-ΔΔCt法計算差異基因的表達水平[27]。

表1 銅綠微囊藻qRT-PCR引物序列Table 1 Sequences of the primer pairs in M.aeruginosa for real-time PCR

2 結果與分析

2.1 轉錄組數據整體評價

轉錄組樣品建庫、測序后的原始序列質量見表2。銅綠微囊藻在波吉卵囊藻濾液中培養4 d，得到 (6.17±0.39)×107原始讀數（Reads），在BG11培養基中培養4 d（對照組）得到 (6.04±0.31) × 107原始讀數。分析表明，實驗組和對照組Q20（堿基識別準確率在99%以上的堿基占比）均高于97%，Q30（堿基識別準確率在99.9%以上的堿基占比）高于94%。經過濾，去除含接頭、低質量讀數，所得各樣品過濾后讀數占原始數據比例均高于81%。可見，轉錄組測序結果較佳，保證了后續分析準確性。

表2 轉錄組測序數據質量統計Table 2 Quality analysis of sequence after filtration

2.2 差異表達基因分析

經比較，獲得1483個差異表達基因，其中788個上調，695個下調。基因差異表達火山圖（圖1）可見，除功能未知的假定蛋白外，上調最顯著的基因功能分類為磷酸鹽結合蛋白（Phosphate-binding proteins），而下調最顯著的基因為短鏈脫氫酶（Short chain dehydrogenase）。差異表達最顯著的前14個基因中，磷酸ABC轉運蛋白（Phosphate ABC transporter）和 NADH 脫氫酶（NADH dehydrogenase）相關功能基因占比較高。

圖1 差異基因表達分析火山圖Fig.1 Volcanic map of differential expressed genes (DEGs)

2.3 差異基因的GO及KEGG分析

GO分類及富集分析結果（圖2）顯示，差異基因在GO的3個大類中所注釋到的數量分別為：分子功能1 212個、生物過程1 276個和細胞組分1 216個。在分子功能子類別中，占比較高的為催化活性（643個）和結合（435個）。在生物過程子分類中，差異基因數量較多的類別為代謝過程（567個）、細胞過程（416個）和定位（111個）。在細胞組分子類別中，膜（348個）和膜部分（328個）占比較高。

將差異基因與KEGG 數據庫比對分析后，516條注釋基因被劃分到108個通路中，level 1層級定位在代謝功能分類的通路最多，達84個。所有通路中富集最顯著的20條通路見表3。氧化磷酸化通路最顯著，有26個差異基因，其中20個基因上調，6個基因下調。富集最顯著的前20條通路中，除RNA降解屬于遺傳信息處理功能，結核屬于人類疾病功能，其余均屬于代謝功能分類。

2.4 氧化磷酸化通路相關基因表達情況

結合KEGG通路分析及轉錄組測序結果，找到經過濾液處理后銅綠微囊藻中與氧化磷酸化通路相關且變化顯著的基因（表4和圖3）。ND3、ND4、ND5、NDUFS2、NDUFS3、ATPF0A、ATPF0B、ATPF0C、PPA、PPK等基因上調顯著，其中，ATPF0B表達上調最為顯著，達9.22倍。SDHA、SDHB、NDUFV2、COX1、NDUFS1、NDUFV1顯著下調。

2.5 差異表達基因的qRT-PCR驗證

14個表達差異顯著基因實時qRT-PCR檢測結果與轉錄組數據的比較如圖4所示。各基因的 log2(差異倍數) 在RNA-seq和qRT-PCR中的數值分別是：NDUFS2，1.34 vs 2.28；ND4，0.98 vs 1.97；ATPF0B，3.65 vs 2.95；ATPF0C，3.15 vs 2.95；ATPBCF，4.85 vs 3.21；ATPF1A，3.2 vs 2.36；ATPF1D，3.07 vs 2.53；ATPF1G，2.04 vs 2.31；PSB27，4.23 vs 3.52；ND5，3.54 vs 2.43；ATPF0A，3.48 vs 2.74）；SDHA，-3.06 vs -3.14；NDUFV2，-3.06 vs -3.67；NDUFV1，-2.90 vs -3.90。這些數值雖有一些差異，但上調和下調表達趨勢均一致，證明了轉錄組數據的可信度。

圖2 差異基因GO分類Fig.2 GO classification of differential gene

表3 差異表達基因KEGG通路分析（前20）Table 3 Statistics of KEGG pathways for DEGs (top 20)

表4 氧化磷酸化通路相關基因表達情況分析Table 4 Statistics of oxidative phosphorylation pathways

圖3 濾液處理后銅綠微囊藻氧化磷酸化通路變化Fig.3 Schematic diagram of oxidative phosphorylation pathway of Microcystis aeruginosaafter filtrate treatment

圖4 轉錄組差異表達基因的qRT-PCR驗證Fig.4 Validation of transcriptome data of differentially expressed genes by qRT-PCR

3 討論

微藻可通過向外界分泌化感物質取得競爭優勢，這些物質配合微藻自身對營養的爭奪往往可有效抑制其他浮游生物生長。化感物質可自然降解，對環境非常友好[28]。研究植物化感作用及作用機制應用前景較廣[29]。微藻間競爭往往伴隨復雜的生物學反應，且影響因素多，而化感脅迫研究還局限于實驗室階段[30]。收集藻類細胞培養液，加入受體生物培養中，是一種研究化感效應有效手段[28]。水華魚腥藻（Anabaena flos-aquae）生長滲出液可有效抑制銅綠微囊藻[31]。劇毒卡爾藻（Karlodinium veneficum）生長濾液可抑制東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）生長[32]。新月菱形藻（Nitzschia closterium）濾液可通過破壞東海原甲藻細胞光合作用、氧化酶及膜系統而抑制其生長[33]。波吉卵囊藻胞外濾液可破壞銅綠微囊藻的細胞膜，引起銅綠微囊藻脂酶活性及光合效率下降[18]。這些研究均通過測試受體微藻的各項生理指標來反映其所受脅迫情況，而在分子機制方面的研究較少。轉錄組測序技術應用范圍廣，精度高，可探索受體生物對脅迫的響應機制[23]。本研究通過對用波吉卵囊藻濾液處理的銅綠微囊藻的高通量測序，在轉錄水平上探討波吉卵囊藻對銅綠微囊藻的抑制機制。

本研究中，DEGs富集到GO數據庫中分子功能、生物過程和細胞組分的數量均高于1200，Wang等[34]在研究硫酸銅對銅綠微囊藻脅迫中亦有類似結果，說明銅綠微囊藻響應類似毒物脅迫需進行一系列復雜生理過程。GO富集到的子類別主要包括催化活性、結合、代謝過程、細胞過程、膜等。擬南芥（Arabidopsis thaliana）響應鎘脅迫[35]，茶樹(Camellia sinensis) 響應高溫脅迫均有相似結果[36]。可見，無論是高等植物還是微藻，應對脅迫均有相似的響應機制。許多研究報道了化感抑制效果對膜的損傷，大麥（Hordeum vulgare）秸稈浸出液可有效破壞銅綠微囊藻的細胞膜[37]，鄰苯二甲酸二丁酯導致短裸甲藻（Gymnodinium breve）發生氧化應激而膜脂過氧化[38]，本研究GO分類富集結果顯示，大量與生物膜相關的功能基因富集到一起，說明銅綠微囊藻的生物膜受到了濾液影響，與波吉卵囊藻胞外濾液可破壞銅綠微囊藻膜結構結果相吻合[18]。

KEGG路徑數據庫可整合大量生物學途徑路徑圖，代表目前學術研究對代謝、遺傳和環境信息處理、細胞過程等分子相互作用和反應網絡的認識[23]，廣泛應用于富集通路分析。本研究中，富集到代謝功能的通路占比最高，其中氧化磷酸化最顯著，與Wang等[34]結果相似。氧化磷酸化是一種代謝途徑，其中細胞使用酶氧化營養物質，體內物質氧化過程所釋放能量提供了合成ATP的偶聯反應過程ADP和無機磷酸鹽[39]。這種代謝途徑在真核生物發生線粒體中，原核生物則發生在漿膜上，比其他厭氧糖酵解等發酵過程更有效釋放能量，因此氧化磷酸化過程存在于大多數需氧生物[40-41]。雖然氧化磷酸化途徑是代謝的主要部分，但它會產生活性氧（ROS），導致自由基增殖，破壞細胞，導致衰老和疾病[42]。富集到氧化磷酸化中的基因，20個上調，6個下調，上調基因多，其中與ATP合成酶有關的基因均顯著上調。ATP合成酶是氧化磷酸化最后一步，也是產生ATP的關鍵步驟[43]。說明銅綠微囊藻在脅迫環境下提高了氧化磷酸化功能，提升了ATP合成效率，更有效獲得能量，以保證正常生命活動；另一方面銅綠微囊藻也可能因此受到氧化損傷。谷胱甘肽（GSH）是一種極重要抗氧化劑，可清除生物體內多余氧自由基，保護細胞膜防止膜脂過氧化[44]。ABC轉運蛋白可利用ATP水解產生的能量協助細胞排出胞內有毒物質和廢物，有助于細胞抵抗氧化脅迫[45]。本研究中，谷胱甘肽通路富集程度高，ABC轉運蛋白相關基因差異表達顯著，說明銅綠微囊藻可能正在面臨氧化損傷的威脅。光合作用是微藻最重要的生理生化過程之一[46]。Wang等[34]發現，在硫酸銅脅迫下，銅綠微囊藻細胞可調控大量與氧化磷酸化和光合作用有關的基因。本研究也出現相似結果，但是光合作用通路的顯著性小于氧化磷酸化。張禮[47]通過分析通路富集情況，認為銀離子對斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）光合過程的影響明顯大于氧化磷酸化。本研究結果則相反，波吉卵囊藻濾液對銅綠微囊藻的氧化磷酸化影響更大。

當氧化應激發生時，呼吸鏈中復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的基因表達量和活性均受影響，其中復合物Ⅰ、復合物Ⅱ和復合物Ⅲ均為ROS的重要來源，復合Ⅳ則不會直接產生ROS[27,48]。本研究中，復合物Ⅰ的ND3、NDUFS2等基因顯著上調，僅NDUFV2、NDUFS1、NDUFV1下調，復合物Ⅱ的SDHA、SDHB下調。其中上調的NDUFS2、NDUFS3是鐵硫蛋白亞基，鐵硫蛋白對維持呼吸鏈中電子傳遞功能穩定有重要作用，同時在各物種中比較保守[49]。黃德玉[49]報道，在T-2毒素誘導24 h的GH3細胞中，NDUFS3及多數呼吸鏈亞基表達顯著增加，與本研究結果相似。這是因為ROS的增加可激活解偶聯蛋白2表達，減少ROS含量[50]。呼吸鏈復合物Ⅱ在三羧酸循環和呼吸電子傳遞鏈中發揮關鍵作用，其中SDHA、SDHB與ROS的產生有關，SDHA突變會導致復合物Ⅱ下降，引起ROS上升[51-52]。此外，SDH活性可一定程度上反映細胞代謝水平[53]。趙文鵬[54]研究顯示，過量氟暴露會誘導ROS大量累積，干擾小鼠卵巢組織中NDUFV2、SDHA的表達，引起呼吸鏈損傷。本研究出現相似結果，說明波吉卵囊藻濾液可能誘導銅綠微囊藻產生過量的ROS，造成氧化損傷。

抗氧化酶系統是化感物質的主要作用靶點，抗氧化系統損傷往往引起膜損傷及光合損傷一系列連鎖反應[55-56]。結合Wang等[18]的研究，推測波吉卵囊藻濾液可能刺激了銅綠微囊藻的氧化磷酸化途徑，在脅迫狀態使其產生過量氧自由基，引起抗氧化酶系統損傷，抑制其生長。生物間相互作用機制極為復雜，本研究是在轉錄水平對波吉卵囊藻抑制銅綠微囊藻作用機制的初步探索。轉錄水平的基因表達并不能代表該基因的具體功能，需要由基因編碼的蛋白質水平體現[23]。本研究所得轉錄組數據可結合蛋白組學、代謝組學進行進一步研究，從而更深刻地剖析波吉卵囊藻對銅綠微囊藻的抑制機理，并應用于藍藻防控工作。