芝麻香型白酒釀造用功能細菌麩曲的優化

田 源，朱國星，司冠儒，梅 婕，張衛衛，張溫清，易 俊，高傳強

（1.江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城 242000；安徽宣酒集團股份有限公司科研中心，安徽宣城 242000）

芝麻香型白酒是建國后通過學創結合所創立的白酒香型，具有“芝麻香突出，諸味協調，豐滿細膩，回味悠長”的風格特點，由于其獨特的風味，使其成為白酒行業中發展最為迅速的白酒香型之一[1]。芝麻香型采用了泥底磚窖、清蒸續米查、大麩結合、高氮配料、高溫堆積、高溫發酵、高溫流酒、長期貯存的工藝技術特點，使其酒體風味特征具有優雅、細膩、飄逸、回味悠長的類似焙炒芝麻的香氣[2-3]。高粱作為主要原料，配以一定比例的小麥和麩皮，增加和豐富了芝麻香型白酒生產釀造原料的蛋白質含量、種類以及氨基酸的構成，為芝麻香型白酒風格的形成提供了基礎[3-4]。

芝麻香型白酒的生產是利用純種群體微生物組合發酵的過程，優質的功能微生物菌種是純種發酵的關鍵之一[1]。因此，微生物菌種及其發酵功能的鑒定是群體微生物得以有效應用的關鍵條件之一。酒醅蛋白水解率是影響芝麻香型白酒酒樣風味質量的重要指標，蛋白水解率的高低也會使芝麻香型白酒的最終發酵結果產生差異[3]。因此，選擇合適的菌種，優化現有工藝生產高產蛋白酶的細菌麩曲對于提高芝麻香型白酒的品質有著重要意義。

本研究對宣酒細菌麩曲的種子培養基進行碳源、氮源優化，提高種子培養液中蛋白酶活力和菌株生物量。并通過優化組合確定了產蛋白酶的最佳組合，提升芝麻香白酒高氮配料中氮源的利用率，為促進制曲工藝的提升及進一步提高芝麻香型白酒品質奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

菌株：宣酒小窖研究所保藏。

營養肉湯培養基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加水至1000 mL，pH 值調至7.2，以115 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄糖40 g，蛋白胨30 g，Na2HPO44 g，K2HPO40.3 g，加水至1000 mL，pH 值調至7.2，以115 ℃滅菌20 min。。

固態發酵培養基：麩皮650 g，豆粕300 g，稻殼50 g，氫氧化鈉4 g，加600 mL水。

1.2 實驗方法

1.2.1 中性蛋白酶酶活測定方法

依據國家標準GB/T 28715—2012[5]，采用福林法測定。中性蛋白酶活力用蛋白酶活力單位表示，定義為1 g 液體或固體酶在40 ℃和pH 7.5 條件下，1 min 水解酪蛋白產生1 μg 酪氨酸，即為1 個酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.2 四甲基吡嗪的測定方法

樣品中四甲基吡嗪的測定采用HPLC-MS法[6]。

1.2.3 高產蛋白酶麩曲固態組合發酵

7 株細菌曲功能菌株接種至裝有50 mL 發酵培養基的250 mL 搖瓶中，37 ℃培養24 h。將培養后的培養液作為種子液按照組合方案的接種量接入裝有70 g 麩皮培養基的500 mL 搖瓶中，37 ℃靜置培養2 d。

稱取10 g 固體樣品，95 ℃烘干至恒重，計算其含水量。稱取固態培養物約5 g，測定蛋白酶酶活。

1.3 發酵培養基產蛋白酶優化

考察不同碳源（可溶性淀粉、蔗糖、甘油、葡萄糖）和氮源（豆粕粉、酵母膏、蛋白胨）種類對產酶的影響，考察甘油質量濃度（20 g/L、30 g/L、40 g/L）、豆粕粉質量濃度（20 g/L、25 g/L、30 g/L）對產酶的影響。

2 結果與討論

2.1 不同碳源對菌株產酶的影響

將發酵培養基中的40 g/L葡萄糖分別用40 g/L可溶性淀粉、蔗糖、甘油替換。其他成分為蛋白胨30 g/L，Na2HPO44 g/L，K2HPO40.3 g/L。以37 ℃、160 r/min 培養24 h，測定6 株菌發酵液上清液中性蛋白酶酶活。結果如圖1 所示，碳源種類對產酶的影響較大，對B2 而言葡萄糖的產酶效果最好，為433.15 U/g，其次為蔗糖、甘油、淀粉，但以甘油為碳源時B2 的生物量最高。而B1、B3、B4、B5、B6 在甘油作為碳源時，酶活最高，同時具備較高的生物量。結合成本、酶活和生物量三方面因素的考量，選擇甘油作為最佳碳源進行后續研究。

圖1 不同碳源對菌株產酶的影響

2.2 不同氮源對菌株產酶的影響

選取甘油為最佳碳源，將發酵培養基中30 g/L蛋白胨分別用豆粕、酵母膏替換。其他成分為甘油40 g/L、Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L。以37 ℃、160 r/min 培養24 h，測定發酵上清液中性蛋白酶酶活。結果如圖2 所示，對B2 而言，豆粕的效果好于另外兩種氮源，酶活最高為548.8 U/g，其次是酵母膏、蛋白胨。當前已有研究表明，無機氮源會抑制蛋白酶的形成[7]，因此沒有考察無機氮源對菌株產酶的影響。

綜合以上研究，選擇豆粕為最佳氮源。

2.3 甘油和豆粕濃度對產酶的影響

圖2 不同氮源對菌株產酶的影響

由上述研究結果可知，B2 產蛋白酶能力遠遠高于另外5 株菌，因此選擇B2 考察甘油和豆粕濃度對產酶的影響。以甘油作為最佳碳源，豆粕為最佳氮源，考察不同甘油濃度對菌株產蛋白酶的影響，設置甘油濃度20 g/L、30 g/L、40 g/L，豆粕20 g/L、25 g/L、30 g/L，其余成分為Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L。對碳源和氮源濃度進行組合，組合如表1所示。

表1 不同濃度甘油、豆粕組合發酵

由表1 可知，單獨調整碳源含量時，20 g/L 的甘油對蛋白酶的合成具有促進作用，酶活最高為561.7 U/g，比30 g/L 和40 g/L 分別提高了9.2 %、10.4 %。適當的碳源濃度有利于菌株的生長和代謝，濃度過高可能由于菌株脫水導致生長遲緩，菌株代謝受阻，影響酶的合成。單獨對氮源含量進行調整時，豆粕質量為20 g/L 時酶活最高，最高為513 U/g，過高的豆粕含量同樣不利于蛋白酶的合成，這可能是由于固形物含量過多，會影響培養基的溶氧，進而影響菌株的生長[8]。

對甘油和豆粕含量進行組合調整時，結果表明，甘油20 g/L、豆粕25 g/L 最利于產酶，此時酶活達到800.2 U/g。綜合評估產蛋白酶的最適條件為甘油20 g/L、豆粕25 g/L。

2.4 接種量和轉速對產酶的影響

使用優化后的培養基，考察了5%、8%、10%、15%4 個接種量對B2 產酶的影響，以37 ℃、160 r/min培養24 h，測定其上清液中性蛋白酶活力。如表2所示，在一定范圍內，隨著接種量的增加，蛋白酶酶活逐漸升高，10%的接種量酶活最高，為820.3 U/g。因此在實際生產上，在合理的范圍內適當增加接種量有助于提高蛋白酶酶活。

表2 接種量和轉速條件優化

同時，考察了160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min 4 個轉速條件對B2 產酶的影響。結果表明，隨著轉速提升，蛋白酶酶活逐步增加。說明提高轉速，增加培養基的溶氧，有利于蛋白酶的產生，在后續的上發酵罐培養時，可以利用此特性來提高蛋白酶酶活。

2.5 功能性細菌三角瓶固態發酵高產蛋白酶配方組合研究

由上可知，6 株芽孢桿菌的產蛋白酶能力差異較大，但菌株在生產中除了提供蛋白酶以外，對多種香氣成分的合成影響較大。因此考慮對6 株菌進行組合培養，在提高蛋白酶的同時充分發揮各個菌株的特性。使用優化后的培養基對細菌麩曲菌株進行純種培養，并進行固態麩皮的組合發酵。上述研究可知B2 具有較強的蛋白酶活力，通過提高B2 的含量提高麩曲的蛋白酶活力。并且已有研究表明104 具有較高的蛋白酶酶活，同時四甲基吡嗪（TTMP）的合成能力較強[9]，在固態麩皮培養基中添加104，可以進一步增加曲中蛋白酶酶活，同時具有提升四甲基吡嗪等指標的潛力。選擇B1、B2、B3、B4、B5、B6 和104 進行組合設計，進行配方優化，提升細菌麩曲品質。

使用優化后的培養基純種培養7 株菌種子液，按照配方優化組合（表2）方案，按比例接種到麩皮固態發酵培養基進行發酵，探尋產蛋白酶及四甲基吡嗪的最佳組合，分別對混合發酵結束的功能性細菌麩曲的四甲基吡嗪、蛋白酶、水分等指標進行測定，結果見表3，固態組合發酵結果見表4。

表3 配方設計

表4 固態組合發酵結果

10 個組合中有4 個組合蛋白酶活力達到一級曲的標準（蛋白酶酶活＞150 U/g）,有7 個組合達到二級曲的標準（蛋白酶酶活＞100 U/g）。其中A9組合的蛋白酶酶活最高，為337.6 U/g。B2 或者104比例的調整對蛋白酶酶活有著較大的影響，但是蛋白酶酶活并不是隨著B2 或者104 的比例的增加呈現線性的增長，而是在某些特定的比例下表現出較高的酶活，說明B2 或者104 比例的增加會提高細菌麩曲的蛋白酶酶活，但是其也受到其余菌株的影響，只有適宜的菌株和合適宜比例的混合發酵才會充分發揮出菌株的優勢。就TTMP 而言，細菌麩曲中TTMP 含量隨著B2 比例的增加而增加，說明B2的存在有助于細菌麩曲中TTMP 的形成。組合A4的TTMP 含量最高，為2.8245 mg/L，但其蛋白酶酶活僅有109.8 U/g。而組合A9 具有較高蛋白酶酶活，同時TTMP 含量適中，今后可以在A9 組合的基礎上進一步優化固態發酵體系，在保障蛋白酶的同時提高TTMP的含量，提升麩曲品質。

3 結論

本研究通過對細菌麩曲發酵培養基的碳源、氮源進行優化，確定了最優發酵培養基為甘油20 g/L、豆粕25 g/L、Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L。最佳接種量為10 %，最適轉速為220 r/min。在此基礎上，通過對選取的7 株菌株進行固態混合發酵配方組合研究以及不同比例情況下的對比驗證，確定7株菌按照組合A9（B2∶104∶B1∶B3∶B4∶B5∶B6=3∶2∶1∶1∶1∶1∶1）混合發酵時，蛋白酶活力最高，同時能夠產生一定量的四甲基吡嗪。

通過本研究確定了細菌麩曲純種發酵培養基成分和固態組合發酵代謝產蛋白酶的最佳配比，為提高芝麻香型白酒生產中高氮配料中氮源的利用率，促進芝麻香型白酒釀造用細菌曲制曲工藝的提升及改進奠定了基礎，對芝麻香型白酒生產具有重要意義。