血液中酒精含量檢測方法及標準物質研究進展*

宋增良，馮金淼，郭 碩，王曉冰

(河北省計量監督檢測研究院，河北 石家莊 050227)

酒精含量是指車輛駕駛人員血液或呼氣中的酒精濃度[1]。近年來，隨著城鎮化進程加快和機動車保有量的日益增加，道路上的交通事故頻發，酒后駕駛已成為發生惡性交通肇事的主要原因[2]。2011年5月1日生效的《刑法修正案(八)》將醉酒駕駛規定為犯罪并予以相應的刑事處罰，這一強制手段為減少因飲酒導致交通事故，規范駕駛機動車，維護交通安全，起到積極作用。血液中酒精含量檢測是危險駕駛定罪、量刑的主要依據[3]，司法部司法鑒定管理局規定檢測時，統一按照國家標準GB19522，采用GA/T1073或GA/T842規定的方法進行。

檢測血液中酒精含量需以有證標準物質作為參考標準，才能在不同的時間和空間內對物質的統一特性進行有效測量，并能對測量結果進行比較，保證測量結果的可比性和有效性。本文介紹了血液中酒精含量的檢測方法及檢測用標準物質的研究進展，為今后判定車輛駕駛人員是否酒后或醉酒后駕車提供參考借鑒。

1 血液中酒精含量檢驗方法研究

常用檢測血液中酒精含量的方法主要有化學法、酶法和氣相色譜法等[4-6]。

1.1 化學法

化學法主要包括酸性條件重鉻酸鉀氧化分光光度法，原理為：重鉻酸鉀—硫酸溶液與血液中酒精發生氧化還原反應，酒精在酸性條件下被重鉻酸鹽氧化，其濃度與重鉻酸鹽還原量呈正相關，通過測定重鉻酸鹽的反應量計算酒精含量。左保林[4]利用酸性條件重鉻酸鉀氧化分光光度法測定血液中酒精含量，以三氯乙酸為蛋白沉淀劑，4000 rpm離心樣品，上清液經重鉻酸鉀—硫酸溶液氧化，使用紫外可見分光光度計測定595 nm處吸光度值，結果表明0～600 μg/100 mL線性范圍時，血液中酒精濃度線性關系：Y=0.38X+0.044(r=0.9952)。用化學法檢測血液中酒精含量不需精密儀器，操作簡便，成本低，易普及。但檢測過程中靈敏度低，易受外界因素影響，準確性低，此方法正逐漸被替代。

1.2 酶 法

酶法目前已被廣泛使用，其原理是模擬酒精在肝臟中氧化的過程，以三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸為緩沖體系，酒精被乙醇脫氫酶及乙醛脫氫酶催化產生還原型輔酶，在340 nm波長處還原型輔酶有特殊吸收峰，通過分光光度計測定340 nm處還原型輔酶吸收率，間接計算酒精含量。胡云良等[7]利用酶法測定血液中酒精含量，以Tris-HCl緩沖液為反應條件，使用自動生化分析儀對其進行兩點終點法檢測，結果表明在200～1200 mg/L線性范圍時，血液中酒精濃度線性關系：Y=0.997X-3.2(r=0.998)；方法精密度：低濃度和高濃度批內變異系數分別為2.8%、2.5%，批間變異系數分別為3.9%、3.3%；回收率：99.8%，膽紅素(低于159.1 μmol/L)、甘油三酯(低于7.4 mmol/L)、血紅蛋白(低于11.6 g/L)、乙醛(低于0.3 g/L)、異丙醇(低于0.2 g/L)、甲醇(低于0.7 g/L)、甲醛(低于0.6 g/L)時，對檢測結果無明顯影響；酶法與氣相色譜法比較，線性關系：Y=0.993X-9.76(r=0.998)。酶法檢測血液中酒精含量不需使用蛋白沉淀劑去除蛋白，操作簡便，靈敏度相對較高，但還原型輔酶無特異性，檢測結果易受血液中含烴基等化合物干擾。

1.3 氣相色譜法

用氣相色譜法檢測血液中酒精含量，靈敏度高，定量精準，可檢測出10-9甚至10-13級酒精含量，速度快且自動化程度高，適用于分析易揮發有機物。檢測時一般選用氫火焰離子化檢測器，按照不同方法的前處理，分為直接進樣法和頂空氣相色譜法。

直接進樣法原理為使用蛋白質沉淀劑將血液蛋白凝固，離心，用氣相色譜儀-氫火焰離子化檢測器對上清液進行檢測，以醇類標準為平行操作，保留時間進行定性，用內標以醇對內標物峰面積比定量。

代娟等[8]利用樣品直接進入毛細管柱氣相色譜，內標法定量，測定血液中酒精含量，為有效去除蛋白，以5%偏磷酸為蛋白沉淀劑，12000 rpm離心樣品，結果表明濃度為20～160 mg/100 mL線性范圍時，最低檢出限：5 mg/100 mL，血液中酒精濃度線性關系：Y=0.032X-0.0667(r=0.9965)。解潤芳等[9]依據同樣進樣方法，內標法定量，以硫酸鋁鉀為蛋白沉淀劑，2500 rpm離心樣品，結果表明濃度為0.2～1.4 mg/mL線性范圍時，最低檢測限：0.01 mg/mL，血液中酒精濃度線性關系：Y=1.03357X-0.04114(r=0.9993)。氣相色譜直接進樣法前處理操作簡單，檢測時間短，靈敏度高，特異性好，能準確分離血液中酒精并精確定量，但Wasfi等[10]研究表明直接進樣易使血液蛋白堵塞色譜柱小孔和加樣器針頭，影響色譜柱使用壽命，此方法正逐漸被頂空進樣色譜法替代。

頂空進樣色譜法原理為氣相色譜儀與頂空進樣器聯用，將樣品直接置于頂空瓶內，恒溫加熱，使用氫火焰離子化檢測器，以叔丁醇為內標，通過保留時間定性，峰面積定量來分析血液中酒精含量。

張偉等[11]利用頂空氣相色譜，內標法定量，測定血液中酒精含量，結果表明濃度為10～400 mg/100 mL范圍時線性良好，最低檢出限：0.25 mg/100 mL，方法準確性：低濃度和高濃度回收率分別為94.70%、99.26%，方法精密度：低濃度和高濃度相對標準偏差(分別為3.6%、4.3%)均小于5%，說明該方法結果準確。歐陽運富[12]等依據同樣進樣方法，內標法定量，測定血液中酒精含量，結果表明濃度為10～4000 mg/100 mL范圍時線性良好，最低檢出限：3 mg/L，血液中酒精濃度線性關系：Y=0.0047X-0.0324(r=0.9993)，方法準確性：加標質量濃度分別為200 mg/L、800 mg/L、2000 mg/L回收率范圍為98.6%～103%，方法精密度：相對標準偏差范圍為1.8%～3.0%，小于5%，說明該方法結果準確。頂空進樣色譜法作為檢測血液中酒精濃度的標準方法[13-15]，可直接將易揮發氣體進入色譜儀，背景簡單，檢測速度快，且能準確定量，穩定性好，自動化程度高，簡單易行，但頂空氣相色譜法對儀器配置和實驗室條件有較高要求。

2 血液中酒精含量檢測用標準物質研究

為使測量結果有效可靠，不同機構間血液中酒精濃度的結果具有可比性，必然要用有證標準物質。在分析過程中以有證標準物質作為參考標準，才能在不同的時間和空間內對物質的統一特性進行有效測量，并能對測量結果進行比較，保證測量結果的可比性和有效性。因此，研究相應的標準物質相當必要。

目前國內有河南省計量工程技術研究中心和中國計量科學研究院研制了血液中酒精含量檢測用標準物質即水中乙醇溶液標準物質，其中趙迎晨等[16]采用重量-容量法，配制了0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.50 mg/mL、0.80 mg/mL、1.00 mg/mL、2.00 mg/mL、3.00 mg/mL、4.00 mg/mL 8種水中乙醇系列濃度標準物質，采用頂空進樣氣相色譜，進行均勻性、穩定性檢驗，驗證定值結果并評估不確定度。測量結果均勻性檢驗使用單因素方差分析法，0.105 mg/mL、0.203 mg/mL、0.500 mg/mL、0.801 mg/mL、1.00 mg/mL、2.00 mg/mL、3.00 mg/mL、4.00 mg/mL水中乙醇溶液標準物質均勻性檢驗數據統計量分別為1.38、1.47、1.00、1.51、1.53、0.83、1.89、0.75，均小于臨界值2.30，標準物質在95%置信區間內均勻性良好；長期穩定性采用先密后疏原則，在4℃儲存條件考察，經驗模型為直線模型，一年內量值無明顯變化趨勢且穩定性良好，數據均小于2.78；考察(60±5) ℃短期穩定性作為運輸過程中受溫度影響因素，數據均小于3.18，合格。

3 結 語

血液中酒精含量檢測是危險駕駛定罪、量刑的主要依據。上述檢測方法中，化學法操作簡單，易普及，但靈敏度低、還原性物質易影響準確度；酶法預處理過程少，檢測時間短，但易受反應溫度、人體內其他化合物影響；直接進樣氣相色譜法前處理操作簡單，檢測時間短，靈敏度高，但血液蛋白易使色譜柱小孔和加樣器針頭堵塞，影響色譜柱使用壽命；頂空氣相色譜法直接將易揮發氣體進入色譜儀，檢測速度快，靈敏度高，準確，精密度高，因此被廣泛應用，但頂空氣相色譜法對儀器配置和實驗室條件有較高要求。

血液中酒精含量檢測用標準物質使檢測結果有效可靠，不同機構檢測結果具有可比性。以有證標準物質為參考標準，才能在不同時間和空間內對物質統一特性進行有效測量，保證結果的可比性和有效性。因此，研究相應的標準物質相當必要。