硒的形態分析方法綜述*

成 立，胡 良，劉 瑜，鐘智遙，樊后保，熊潤國，江栩昱，鄒云濤，王香蓮，胡盛明

(1 南昌工程學院江西省退化生態系統修復與流域生態水文重點實驗室，江西 南昌 330099;2 江西生物科技職業學院， 江西 南昌 330200)

硒是人體內必不可少的微量元素之一，具有重要的生物學功能。弄清硒的功能和生物效應是闡明硒功能和毒理機制的一個關鍵因素。而硒的生物效應、代謝行為和生物利用率在很大程度上取決于其具體化學形態，元素形態分析是對被分析物中實際存在的化學形式進行識別和定量[1-2]。元素形態分析包括兩方面的技術，一是元素化學形式的分離方法，另一是檢測方法。近年來，高效液相色譜或電泳與高靈敏度的檢測器(比如ICP-MS)結合的聯用技術已經表明是最為有效的分析方法[ 3]。ICP-MS在硒形態分析中以靈敏度高，與其他色譜分離技術易結合，干擾少著稱，所以應用最廣泛[4-5]。

環境和生物樣品中硒形態的定性和定量分析包括許多重要的步驟，這取決于樣品的基體組成，在分析過程中必須充分考慮這些因素。這些步驟包括：采樣、樣品儲存、樣品前處理(包括提取、基體分離、濃縮)、形態分離、測定(包括校正和定量)。每一步都有可能影響整個分析過程中的準確性和對各形態的識別和鑒定，且每一步都需優化、綜合考慮其他步驟以達到分析最佳化。

1 采樣和樣品提取方法

采樣方面包括收集、加工和處理，樣品分離方法的選擇取決于各方面的因素，比如分離和測定的的儀器，且更取決于待分析物的外觀形態和基體效應以及樣品中可能出現的形態等等。硒形態分析應用已逐漸從環境轉向了生物樣品，最大的挑戰就是盡可能從這些復雜的基體樣品中提取原始樣品形態且獲得高回收率。比如，硒氨基酸是水溶性酸，用熱水浸提法可獲得足夠的回收率。硒代氨基酸可通過超濾和透析而達到提取的目的。而硒代半胱氨酸和一些其他的硒氨基酸不穩定易降解，需選擇更有效的提取方法，因為硒比硫在相對應位置上有較低的氧化電勢電位。

2 分離方法

分離硒的化合物可通過色譜和電泳等分離方法完成。分離能力和與ICP-MS接口的兼容性是選擇分離方法的重要標準。對于小分子的無機硒、小分子代謝物、氨基酸或多肽化合物，反相色譜是最強大的分離方法。

2.1 排阻色譜

空間排阻色譜法適合分離大分子化合物，比如蛋白、高分子材料、肽鍵等[6]。鐵梅等利用體積排阻色譜檢測出了富硒金針菇中三種硒多糖，結果驗證了硒參與了生物大分子的合成，具有重要的生物活性[7]。肖俊超等采用體積排阻色譜分析了藻細胞中的三種硒結合形態，研究了硒脅迫對小球藻抗氧化酶活性的影響[8]。

2.2 離子交換色譜

離子交換色譜由待分析物的離子和流動相的離子與柱子上的固定相競爭結合而產生分離。離子交換色譜可以分離無機離子和任何易解離的物質[9-10]。胡良等采用陰離子交換色譜法成功測定血清中的SeCys、SeMet、Se(IV)和Se(VI)等小分子硒形態，并應用于研究長期汞暴露地區硒干預人群中血清的硒形態分析研究[9]。

2.3 反相色譜和反相離子對色譜

反相色譜是高效液相色譜中應用最廣泛的分離方法，色譜柱效高、分離能力強、保留機理清楚，一般是十八烷基、C18或C8辛基鏈結合某種固體材料、微孔硅膠材料。由于流動相是單極的，因此樣品被流動相和固定相分隔開。戊烷陰離子作為離子對試劑可分離三甲基硒離子、硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸。通常情況下，反相離子對色譜與質譜聯用時會帶來光譜或非光譜的干擾。首先，有機溶劑的使用會增加來自碳氫化合物的光譜方面的干擾，因為會增加背景信號。其次，梯度洗脫越來越普遍，但也會給ICP-MS帶來嚴重的基體干擾信號，所以定量分析變得越來越復雜。

2.4 親合色譜

親合色譜與電感耦合等離子體質譜聯用可以分析血清中常見蛋白(谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、Sel-P、Se-Albumin)的含量，親合色譜具有更好的效果，通過親合色譜微柱和低檢測限的ICP-MS聯用，優化和改進霧化器效率和流動相的組成，可以分析出微升級樣品中的硒蛋白P和硒的其它形態[11]。

2.5 電泳技術

電泳技術是基于離子的電泳淌度不同而實現分離的，它有區帶、等速電泳和等電子聚焦三種基本模式。它常用于分離相對穩定的形態，分辨率高，一般和靈敏度極高的檢測器比如ICP-MS聯用[12]。黃峰等采用SDS-PAGE電泳技術實現了富硒螺旋藻中總蛋白的分離，并利用ICP-MS精測測定各分子量蛋白質中的硒含量[13]。

2.6 多維分離方法

硒形態分析也可以先通過多維色譜分離純化后，再串聯質譜對硒進行定量分析。根據電荷大小及極性它們還可以通過陰離子交換色譜分離成更小的蛋白組分，而未分離的陽離子和不帶電的中性化合物需要進一步通過陽離子交換色譜分離，通過二維或三維分離的化合物可通過四極桿或TOF質譜測定[14-15]。

3 定量方法

3.1 色譜定量

色譜法是根據色譜峰的面積或高度進行定量分析的。色譜定量計算方法很多，目前比較廣泛應用的有歸一化法、內標法和外標法。

3.2 ICP-MS定量測定硒形態

電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)具有靈敏度高、圖譜簡單、檢出限低、線性范圍寬，能同時進行多元素分析和同位素分析的優點。一般情況下，可通過用混合氣體(氙，氦等)，優化調節質譜條件(比如低壓，冷卻)或利用減少多原子離子干擾的提取鏡等方法，來使干擾降到最小。當它用來作為色譜檢測器測量分離前的總硒時，多原子離子干擾不容易產生。研究表明，用甲烷作反應氣，ICP-DRC-MS作為檢測器成功應用于分析硒的六種同位素[16]。大約可以消除氬的五個數量級的干擾。因此可以通過檢測硒的主要同位素80Se來達到較高的靈敏度[16]。 ICP-MS 儀器經歷了四極桿質譜儀(ICP-QMS)、高分辨雙聚焦質譜儀(HR-ICP-MS)和多接收高分辯雙聚焦質譜儀(MC-ICP-MS)三個發展階段。其分離離子的方式有四極桿、飛行時間和扇形分析器等。飛行時間質譜能夠很好的與GC和CE結合，且有著采集數據速度快的特點，所以它在形態分析應用上有著潛在發展空間。用高分辨率質譜和動態反應池(碰撞池)可部分地消除多原子離子干擾。尤其在捕獲同位素的短暫信號方面，多接收器比單接收器能獲得更高的準確度。為了得到更高的分辨率和減少多原子離子干擾，可應用雙聚焦扇形質譜，但增加分辨率的同時，也降低了靈敏度。在靈敏度和分辨率方面，只能妥協折中選擇，因為增加靈敏度的同時必會降低分辨率。

3.3 同位素稀釋法定量(Isotope dilution analysis(IDA))

根據加入同位素稀釋劑的形式，可以將同位素稀釋法分為特異示蹤模式和非特異示蹤模式。特異示蹤模式(Species-specific spike)是同位素稀釋劑與待測樣品先相互混勻后再進行分離和檢測的。其應用的前提是樣品中的形態和組成是已知的。非特異示蹤模式(Species-unspecific spike)，也叫柱后同位素稀釋法，首次于Rottman和 Heumann在1994年提出，在這種模式中，稀釋劑在待測物質通過高效液相色譜分離后再和分離后的待測樣品的不同形態一起進入電感耦合等離子體質譜中進行檢測。此后可得到待測元素的不同同位素的時間圖譜以及同位素比值圖譜，然后通過柱后同位素稀釋法公式可將每一時間點的待測元素比值換算成相對應的時間質量流譜圖。待測樣品中不同形態的濃度含量可通過先算出色譜圖中相應峰的峰面積，再與進樣量相比得到。

柱后同位素稀釋法方程是根據樣品和稀釋劑中待測元素混合前后質量守恒推導得到的。即由公式Nm=Ns+NSp推算出，雖有文獻報道其它形式公式但其原理實質是一樣的。其中影響準確測量同位素比率的參數有光譜干擾、儀器的死時間和質量歧視等；影響精確測量同位素比率的參數有離子計數統計、當前待測離子的穩定度和同位素稀釋法中隨機誤差的傳遞等。

柱后同位素稀釋法所加入的同位素稀釋劑的化學形態與被分析物種不同。這種測定模式的優點是可以對未知結構化合物進行形態分析，能夠準確測定樣品中存在的未知化合物的濃度[17]。這是其他定量方法，比如標準加入法所無法比擬的，因為加入的元素形態與被分析的元素形態往往是不能完全一致的，所以它們的化學性質也不會相同。由于ICP-MS的離子源的離子化效率與元素存在的形態無關，因此非特異示蹤模式經常與ICP-MS聯用來測定各種化合物的濃度[18]。由于硒在人體組織、器官、體液中的作用機理、代謝規律還未完全闡述清楚。故有不少分析工作者長期致力于硒形態分析的研究，近幾年來，有較多篇文獻報道采用柱后同位素稀釋法分析GPx, Sel-P, Albumin中的硒含量，以揭示生物體內不同含硒蛋白中硒元素的分布規律[11]。

4 結 語

在未來的幾年，硒形態分析的重要性仍然會快速發展。ICP-MS作為檢測方法與HPLC、GC和CE聯用因靈敏度高、檢則限低必然是首選。最后，進一步鑒別各種不同樣品中更多硒的形態將面臨更大挑戰。為得到更精切的硒蛋白和硒化合物信息，比ICP-MS更靈敏的類似分析技術也將會快速發展成熟。類似電噴霧和表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜技術在硒形態分析中將得到更好的應用與發展。金屬蛋白組學領域的生物無機形態分析也是一個重點討論的話題，在硒形態分析研究中也將成為熱點。