miR-384靶向HTRA1影響瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖和凋亡

王 東 王 珍 劉 巖

沈陽市第七人民醫(yī)院皮膚科，遼寧沈陽，110003

瘢痕疙瘩是皮膚損傷后傷口愈合過程異常形成的良性皮膚腫瘤，以成纖維細胞過度增殖和細胞外基質(zhì)過度沉積為特征[1]。雖然瘢痕疙瘩為良性皮膚腫瘤，但其并不會隨著時間推移而消退，常常伴有瘙癢和疼痛，嚴重影響患者身心健康。此外，瘢痕疙瘩臨床治療效果不佳，手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率高。因此，亟需開發(fā)有效的治療方法。微小RNA(microRNA，miRNA)是長度約為22 nt的非編碼RNA，其通過與靶基因3’非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制靶基因表達，從而影響細胞增殖、代謝、凋亡等多種生理和病理過程。有證據(jù)表明miRNA表達失調(diào)有助于瘢痕疙瘩形成[2,3]。miR-384已被證實在骨肉瘤[4]、腎細胞癌[5]等惡性腫瘤中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可降低腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細胞凋亡。然而miR-384在瘢痕疙瘩中的生物學(xué)功能尚不清楚。因此，本研究旨在通過體外細胞實驗闡明miR-384在瘢痕疙瘩形成中的作用和分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人瘢痕疙瘩成纖維細胞(keloid fibroblasts，KFBs)購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清為美國Hyclon公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000、Trizol試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；miR-384抑制物(anti-miR-384)及其對照(anti-miR-NC)、miR-384模擬物(miR-384 mimics)及其對照(miR-NC)、HTRA1小干擾RNA(si-HTRA1)及其對照(si-con)、PCR引物由廣州復(fù)能基因公司提供；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、SYBR?Premix ExTaq為大連Takara公司產(chǎn)品；細胞計數(shù)試劑盒8(Cell count kit 8，CCK-8)、膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染法細胞凋亡檢測試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；兔源高溫需求因子A1(high temperature requirement A1，HTRA1)抗體、兔源Ki-67抗體、兔源增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體、兔源B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體和兔源Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體、山羊抗兔IgG為美國Abcam公司產(chǎn)品。

1.2 組織來源 45例標本取自2016年3月至2018年10月于我院住院患者成對瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織標本，并經(jīng)我院病理科確診。所有患者均未接受放、化療等治療，并排除腫瘤、家族遺傳病、感染患者。其中男18例，女27例。本實驗在開展前已獲得每位患者知情同意，并獲得我院倫理委員會批準。

1.3 細胞培養(yǎng)和分組 KFBs在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中于37℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)Lipofectamine 2000使用說明書將anti-miR-NC、anti-miR-384、si-con、si-HTRA1、anti-miR-384+si-con、anti-miR-384+si-HTRA1分別轉(zhuǎn)染KFBs，同時設(shè)置對照(Control)組，48 h時收集細胞，檢測轉(zhuǎn)染效果合格后進行后續(xù)實驗。

1.4 RT-qPCR檢測miR-384和HTRA1 mRNA的表達水平 采用Trizol試劑分別從人正常皮膚組織、瘢痕疙瘩皮膚組織、HSF和各組KFBs中提取總RNA。利用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA，并利用SYBR?Premix ExTaq進行RT-qPCR檢測miR-384和HTRA1 mRNA的表達水平。U6和β-actin分別作為miRNA和mRNA的內(nèi)源性參照，利用2-△△Ct法計算miR-384和HTRA1 mRNA的表達量。引物序列如下：miR-384上游5′-TGTTAAATCAGGAATTTTAA-3′，下游5′-TGTTACAGGCATTATGAA-3′；U6上游5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′，下游5′-GTACAACACATTGTTTCC-TCGGA-3′；HTRA1上游 3′-TTGTTTCGCAAGCTTCCGTT-5′，下游3′-ACGTG-GGCATTTGTCACGAT-5′；β-actin：上游5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖活力 將各組KFBs接種到96孔板，接種密度為1×106cells/孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱孵育2 h，在450 nm波長處檢測各孔細胞的吸光度值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 細胞轉(zhuǎn)染48 h時，消化后收集懸浮細胞，預(yù)冷的PBS液洗滌細胞后，加入結(jié)合緩沖液制備細胞密度為1×106cells/mL的單細胞懸液。取100 μL細胞懸液，分別加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，室溫避光孵育15 min，再加入5 μL的PI染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7 Western Blot檢測HTRA1、Ki-67、PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達 采用RIPA裂解緩沖液提取人正常皮膚組織、瘢痕疙瘩皮膚組織、HSF和各組KFBs的總蛋白，二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒進行定量。利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶室溫封閉膜1 h，洗膜后，用稀釋的一抗溶液4℃孵育膜過夜，洗膜后，加入稀釋的二抗室溫孵育膜1 h。使用增強型化學(xué)發(fā)光試劑顯影，Image J軟件分析目的蛋白的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算其相對表達水平。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?含有miR-384結(jié)合位點的野生型(WT-HTRA1)或含有miR-384結(jié)合位點突變序列的突變型(MUT-HTRA1)熒光素酶報告基因載體由廣州復(fù)能基因公司提供。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-384 mimics、miR-NC分別與WT-HTRA1或MUT-HTRA1共轉(zhuǎn)染KFBs，48 h后，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)測定各組KFBs熒光素酶活性。同時將miR-384 mimics、miR-NC分別轉(zhuǎn)染KEIFIB細胞，48 h后，RT-qPCR和Western Blot檢測HTRA1的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 miR-384和HTRA1在人瘢痕疙瘩成纖維細胞和組織中的表達情況 如表1和圖1所示，相較于人正常皮膚成纖維細胞HSF，人瘢痕疙瘩成纖維細胞中miR-384的表達量顯著降低，HTRA1 mRNA和蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。如表2和圖2所示，相較于正常皮膚組織，人瘢痕疙瘩組織中miR-384的表達量顯著降低，HTRA1 mRNA和蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。

表1 qRT-PCR和western blot檢測人瘢痕疙瘩成纖維細胞中miR-384、HTRA1 mRNA和蛋白的表達

表2 qRT-PCR和Western Blot檢測人瘢痕疙瘩組織中miR-384、HTRA1 mRNA和蛋白的表達

2.2 miR-384敲減對KFBs增殖和凋亡的影響 如表3、4和圖3、4所示，與對照組和轉(zhuǎn)染anti-miR-NC比較，轉(zhuǎn)染anti-miR-384后KFBs miR-384表達量顯著降低，細胞活力顯著增加，細胞凋亡率顯著降低，Ki-67、PCNA和Bcl-2蛋白的表達顯著升高，Bax蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。

表3 miR-384敲減對KFBs增殖和凋亡的影響

表4 miR-384的敲減對KFBs增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

2.3 miR-384靶向負調(diào)控HTRA1 生物信息學(xué)分析工具ENCORI在線預(yù)測顯示miR-384與HTRA1之間存在相互作用，見圖5。雙熒光素酶報告實驗驗證二者靶向關(guān)系顯示，miR-384 mimics和WT-HTRA1共轉(zhuǎn)染組KFBs熒光素酶活性與miR-NC和WT-HTRA1共轉(zhuǎn)染組比較顯著降低(P<0.05)；miR-384 mimics和MUT-HTRA1共轉(zhuǎn)染組KFBs熒光素酶活性與miR-NC和MUT-HTRA1共轉(zhuǎn)染組比較無明顯變化，見表5。RT-qPCR和Western Blot檢測顯示，與對照組、轉(zhuǎn)染miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-384 mimics后KFBs HTRA1 mRNA和蛋白的表達顯著降低(P<0.05)，見表6。提示miR-384靶向負調(diào)控HTRA1表達。

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 miR-384調(diào)控HTRA1蛋白表達

2.4 干擾HTRA1對KFBs增殖和凋亡的影響 如表7、8和圖7、8所示，與對照組和轉(zhuǎn)染si-con比較，轉(zhuǎn)染si-HTRA1后HTRA1 mRNA和蛋白的表達顯著降低，細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著增加，Ki-67、PCNA和Bcl-2蛋白的表達顯著降低，Bax蛋白的表達顯著升高(P<0.05)。

表7 干擾HTRA1對KELFIB細胞增殖和凋亡的影響

2.5 干擾HTRA1逆轉(zhuǎn)了抑制miR-384對KELFIB細胞的影響 如表9、10和圖9、10所示，與轉(zhuǎn)染anti-miR-384比較，轉(zhuǎn)染anti-miR-384后KFBs活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，Ki-67、PCNA和Bcl-2蛋白的表達顯著升高，Bax蛋白的表達顯著降低；與轉(zhuǎn)染anti-miR-384+si-con比較，轉(zhuǎn)染anti-miR-384+si-HTRA1后KFBs活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，Ki-67、PCNA和Bcl-2蛋白的表達顯著降低，Bax蛋白的表達顯著升高(P<0.05)。

圖1 人瘢痕疙瘩成纖維細胞中HTRA1蛋白的表達 圖2 人瘢痕疙瘩組織中HTRA1蛋白的表達 A：人正常皮膚組織；B：人瘢痕疙瘩皮膚組織

圖3 TRAIL對KFBs凋亡的影響 圖4 miR-384的敲減對KFBs增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖5 HTRA1的序列中含有與miR-384互補的核苷酸序列 圖6 miR-384調(diào)控HTRA1表達

圖7 抑制HTRA1對KELFIB細胞凋亡的影響 圖8 干擾HTRA1對KFBs增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

表8 干擾HTRA1對KFBs增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

表9 干擾HTRA1逆轉(zhuǎn)了抑制miR-384對KFBs增殖和凋亡的影響

圖9 干擾HTRA1逆轉(zhuǎn)了抑制miR-384對KFBs凋亡的影響

圖10 干擾HTRA1逆轉(zhuǎn)了抑制miR-384對KFBs增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討論

最近研究表明，miRNA在瘢痕疙瘩形成中具有重要作用，是治療該病的潛在靶點[6,7]。miR-384是一種多功能miRNA，參與包括細胞生長、增殖、凋亡和遷移在內(nèi)的多種細胞過程。研究顯示miR-384在乳腺癌中表達下調(diào)，上調(diào)miR-384可降低乳腺癌體內(nèi)外增殖和遷移能力發(fā)揮抑癌基因作用[8]。在非小細胞肺癌中miR-384也呈低表達，上調(diào)miR-384可降低非小細胞肺癌細胞的增殖和致瘤能力，誘導(dǎo)細胞凋亡和自噬[9]。此外，上調(diào)miR-384還可抑制喉癌細胞增殖，提高caspase-3活性，誘導(dǎo)細胞凋亡[10]。本研究數(shù)據(jù)顯示，miR-384在人瘢痕組織和KFBs細胞中的表達分別低于正常皮膚組織和HSF細胞。功能實驗顯示，抑制miR-384表達可促進KFBs細胞增殖，抑制細胞凋亡。進一步分析顯示，抑制miR-384表達還可升高促增殖蛋白PCNA和Ki-67、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，降低促凋亡蛋白Bax的表達水平。因此，需要進一步研究來闡明miR-384在瘢痕疙瘩形成中的分子機制。

為揭示miR-384在瘢痕疙瘩形成中的分子機制，采用生物信息學(xué)軟件進行靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)HTRA1是miR-384的潛在靶基因，并通過雙熒光素酶報告實驗、RT-qPCR、Western blot檢測證實miR-384靶向HTRA1并負調(diào)控其表達。HTRA1是一種絲氨酸蛋白酶，由四個不同的功能域組成，是HTRA家族中最先被發(fā)現(xiàn)的成員。研究表明瘢痕疙瘩中HTRA1表達增加，沉默HTRA1可抑制KFBs的增殖和細胞外基質(zhì)沉積[11,12]。miR-494-3p通過靶向HTRA1可降低KFBs增殖、遷移和膠原蛋白合成能力，促進KFBs凋亡和細胞周期阻滯[13]。與前人研究結(jié)論相似，本研究發(fā)現(xiàn)HTRA1在人瘢痕組織和KFBs中的表達分別高于正常皮膚組織和HSF細胞，干擾HTRA1表達可降低KFBs的增殖能力，促進細胞凋亡，降低Bax、升高PCNA、Ki-67和Bcl-2蛋白的表達。然而，在胰腺癌[14]、胃癌[15]、卵巢癌[16]等惡性腫瘤中HTRA1表達下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。此外，干擾HTRA1還可逆轉(zhuǎn)抑制miR-384表達對KFBs增殖促進和凋亡抑制作用。

綜上所述，瘢痕疙瘩中miR-384呈低表達，miR-384低表達通過靶向HTRA1可促進KFBs增殖和抑制細胞凋亡，是瘢痕疙瘩形成的重要促進因素。因此，miR-384是瘢痕疙瘩治療的潛在靶點。