早期隱性梅毒對(duì)慢性HIV感染者CD4+T及CD8+T淋巴細(xì)胞內(nèi)Caspase-1/3水平的影響

宋冰冰 趙金雪 翁文佳 高艷青

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院皮膚科,北京，100041；2北京市房山區(qū)第一醫(yī)院皮膚科，北京，102400；3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院皮膚科，北京，100069

隨著HIV/AIDS的流行及其他危險(xiǎn)因素的增多，如男男性接觸(men who have sex with men，MSM)、靜脈注射毒品，梅毒合并HIV的感染率越來(lái)越高。研究發(fā)現(xiàn)兩種疾病可相互作用，如梅毒合并HIV感染且CD4+T淋巴細(xì)胞<350個(gè)/μL，發(fā)生神經(jīng)梅毒概率增高[1，2]；另外，合并梅毒感染會(huì)加快HIV患者CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)下降、HIV載量升高，促進(jìn)HIV感染進(jìn)展為AIDS[3]。既往課題組研究[4]發(fā)現(xiàn)梅毒感染加快HIV感染者CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡，并且除了活化誘導(dǎo)的凋亡外，可能存在其他的機(jī)制。而對(duì)于HIV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)HIV有效感染的活化CD4+T細(xì)胞發(fā)生死亡是通過(guò)Caspase-3介導(dǎo)的凋亡，HIV無(wú)效感染的靜止CD4+T淋巴細(xì)胞發(fā)生死亡是通過(guò)Caspase-1誘導(dǎo)的焦亡[5]。而梅毒是否能通過(guò)上述途徑加速CD4+T及CD8+T淋巴細(xì)胞的死亡尚未有明確報(bào)道。本研究通過(guò)觀察早期梅毒感染對(duì)HIV感染者CD4+T及CD8+T細(xì)胞Caspase-1/3水平的影響，初步探索早期隱性梅毒感染對(duì)HIV感染者外周血中CD4+T及CD8+T淋巴細(xì)胞凋亡和焦亡的影響。

1 材料與方法

1.1 病歷資料 研究對(duì)象來(lái)自我院感染中心規(guī)律隨訪的MSM隊(duì)列。18例早期隱性梅毒合并慢性HIV感染(外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)≥350個(gè)/μL，HIV感染時(shí)間>6個(gè)月) ，早期隱性梅毒定義為感染2年內(nèi)僅有梅毒血清學(xué)改變，但無(wú)任何臨床表現(xiàn)；18例慢性 HIV感染(外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)≥350個(gè)/μL，HIV感染時(shí)間>6 個(gè)月)。除外年齡<18歲、妊娠、合并其他感染性疾病者，如結(jié)核感染等。合并組確診梅毒后經(jīng)過(guò)芐星青霉素240萬(wàn)U驅(qū)梅治療，每周一次，共三次。所有HIV感染者均未進(jìn)行抗高效逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者基線資料

1.2 研究方法

1.2.1 Ficoll-Hypaque密度離心法分離PBMC 合并組及HIV感染組取凍存PBMC，于42℃恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，快速晃動(dòng)凍存管，使凍存的細(xì)胞在1 min內(nèi)解凍。

1.2.2 熒光染色 復(fù)蘇好的PBMC加入表面抗體標(biāo)記(CD3-APC，CD4-PERCP，CD8-APC-cy7)，室溫避光染色20 min。細(xì)胞內(nèi)染色：加入Caspase-3，Caspase-1抗體，室溫孵育45 min，PBS洗滌2次后，用2%多聚甲醛重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 CD4/CD8及細(xì)胞內(nèi)Caspase-1/Caspase-3測(cè)定 采用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)，并采用 Flowjo 7.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組CD4+T淋巴細(xì)胞中Caspase-1/3含量的比較 見(jiàn)圖1、2 。單純HIV感染組及合并組CD4+T淋巴細(xì)胞中Caspase-1含量分別為(0.132±0.098)、(0.463±0.676)，合并組高于單純HIV組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；單純HIV感染組及合并組CD4+T淋巴細(xì)胞中Caspase-3含量分別為(4.717±7.35)、(9.433±11.85)，兩組未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 HIV單純感染組和HIV合并早期隱性梅毒感染組中CD4+T淋巴細(xì)胞中Caspase-1含量情況，*P<0.05 圖2 HIV單純感染組和HIV合并早期隱性梅毒感染組中CD4+T淋巴細(xì)胞中Caspase-3含量情況，*P<0.05 圖3 HIV單純感染組和HIV合并早期隱性梅毒感染組中CD8+T淋巴細(xì)胞中Caspase-1含量情況，*P<0.05 圖4 HIV單純感染組和HIV合并早期隱性梅毒感染組中CD8+T淋巴細(xì)胞中Caspase-3含量情況，*P<0.05

2.2 兩組CD8+T淋巴細(xì)胞中Caspase-1/3含量的比較 見(jiàn)圖3、4。單純HIV感染組及合并組CD8+T淋巴細(xì)胞中Caspase-1含量分別為(0.127±0.094)、(0.334±0.456)，合并組高于單純HIV組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；單純HIV感染組及合并組CD8+T淋巴細(xì)胞中Caspase-3含量分別為(8.47±14.78)、(16.23±14.91)，兩組未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 合并組治療6個(gè)月后CD4+T淋巴細(xì)胞中Caspase-1/3含量與基線的比較 芐星青霉素驅(qū)梅治療6個(gè)月后，CD4+T淋巴細(xì)胞中Caspase-1含量為(0.156±0.103)，較治療前下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Caspase-3含量為(2.32±3.925)，較前明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5、6。

2.4 合并組治療6個(gè)月后CD8+T淋巴細(xì)胞中Caspase-1/3含量與基線的比較 芐星青霉素驅(qū)梅治療6個(gè)月后，CD8+T淋巴細(xì)胞中Caspase-1含量為(0.158±0.108)，較治療前下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Caspase-3含量為(2.38±2.05)，較前明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖7、8。

2.5 單純HIV感染組6個(gè)月定期隨訪時(shí)CD4+T淋巴細(xì)胞中Caspase1/3含量分別為(0.076±0.066)及(1.53±1.828)，CD8+T淋巴細(xì)胞中Caspase1/3含量分別為(0.067±0.07)及(2.156±3.026)，均與基線無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖5 HIV合并早期隱性梅毒感染組在治療前和治療6個(gè)月后CD4+T淋巴細(xì)胞中Caspase-1含量變化情況，*P<0.05 圖6 HIV合并早期隱性梅毒感染組在治療前和治療6個(gè)月后CD4+T淋巴細(xì)胞中Caspase-3含量變化情況，*P<0.05 圖7 HIV合并早期隱性梅毒感染組在治療前和治療6個(gè)月后CD8+T淋巴細(xì)胞中Caspase-1含量變化情況，*P<0.05 圖8 HIV合并早期隱性梅毒感染組在治療前和治療6個(gè)月后CD8+T淋巴細(xì)胞中Caspase-3含量變化情況，*P<0.05

3 討論

HIV感染后，會(huì)攻擊人體免疫系統(tǒng)，人體細(xì)胞免疫會(huì)明顯受損，而梅毒是以細(xì)胞免疫為主參與梅毒螺旋體的清除[2，6，7]。故既往研究[8，9]發(fā)現(xiàn)二者可相互影響，促進(jìn)疾病發(fā)展，及時(shí)有效的治療對(duì)疾病的轉(zhuǎn)歸會(huì)有幫助。

在HIV感染過(guò)程中，CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行性減少是疾病進(jìn)展的核心環(huán)節(jié)。既往研究[10]發(fā)現(xiàn)HIV感染的CD4+T淋巴細(xì)胞減少與凋亡密切相關(guān)，但隨著研究的深入，不同于凋亡與壞死的一種新的程序性細(xì)胞死亡方式-焦亡被發(fā)現(xiàn)，它是由Caspase-1介導(dǎo)，在許多感染性疾病中發(fā)揮重要作用。在HIV感染的致病機(jī)制研究中認(rèn)為，CD4+T淋巴細(xì)胞主要通過(guò)焦亡的方式對(duì)病毒DNA作出反應(yīng),從而促進(jìn)前炎癥因子釋放,使大量健康CD4+T淋巴細(xì)胞募集到感染區(qū)域,為HIV感染提供新的細(xì)胞資源,最后導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞死亡,形成惡性循環(huán)[11]。目前認(rèn)為HIV有效感染的活化CD4+T淋巴細(xì)胞發(fā)生死亡是通過(guò)Caspase-3介導(dǎo)的凋亡，HIV無(wú)效感染的靜止CD4+T淋巴細(xì)胞發(fā)生死亡是通過(guò)Caspase-1誘導(dǎo)的焦亡[10，11]。

目前研究認(rèn)為梅毒螺旋體的清除主要是通過(guò)細(xì)胞免疫參與。在梅毒感染的過(guò)程中，其外周血T淋巴細(xì)胞亞群不斷發(fā)生變化。既往研究顯示[12]，二期梅毒患者外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞比例顯著降低,而CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著升高,CD4+∶CD8+比值降低;而一期和潛伏梅毒患者, CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的比例無(wú)顯著變化。此研究表明T淋巴細(xì)胞亞群在梅毒的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，不同梅毒分期T淋巴細(xì)胞亞群變化的機(jī)制可能揭示梅毒的致病機(jī)制。另外發(fā)現(xiàn)，一、二期梅毒患者外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡比例明顯升高，而早期潛伏梅毒患者CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡比例增高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示不同分期梅毒患者外周T淋巴細(xì)胞死亡機(jī)制可能不同。關(guān)于梅毒螺旋體感染過(guò)程中T淋巴細(xì)胞亞群的焦亡情況尚無(wú)研究報(bào)道，本課題組目前正在對(duì)不同分期的單純梅毒感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群焦亡及凋亡情況進(jìn)行研究。本研究初步分析梅毒螺旋體感染對(duì)梅毒合并HIV共感染者外周血中CD4/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群焦亡和凋亡的影響，提高我們對(duì)梅毒和AIDS病理機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步深入研究提供基礎(chǔ)。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)早期隱性梅毒合并HIV感染CD4+T淋巴細(xì)胞及CD8+T淋巴細(xì)胞中焦亡指標(biāo)Caspase-1較單純HIV感染組明顯升高，反應(yīng)在一定程度上梅毒可能通過(guò)焦亡途徑加速共感染者中CD4+T淋巴細(xì)胞及CD8+T淋巴細(xì)胞的死亡。合并組中CD4/CD8+T淋巴細(xì)胞雖然凋亡指標(biāo)Caspase-3也呈增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，一方面可能與樣本量較小有關(guān)，另一方面，本研究組為早期隱性梅毒患者，免疫反應(yīng)不如一期、二期梅毒強(qiáng)烈，這與既往單純?cè)缙陔[性梅毒未增加CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡相符[12]。另外，在經(jīng)過(guò)芐星青霉素驅(qū)梅治療后，CD4/CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡指標(biāo)Caspase-3明顯下降，反應(yīng)及時(shí)有效的驅(qū)梅治療可以降低梅毒螺旋體對(duì)CD4/CD8+T淋巴細(xì)胞的影響。驅(qū)梅治療對(duì)焦亡指標(biāo)Caspase-1的水平雖有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

梅毒和AIDS都是性傳播疾病，T淋巴細(xì)胞在二者的病理機(jī)制中具有重要意義，探索兩種感染對(duì)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞不同的程序死亡通路的影響，可以提高我們對(duì)梅毒和AIDS病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)，有助于研發(fā)新的有效控制梅毒感染和AIDS進(jìn)展的治療策略。同時(shí)，梅毒的早期診斷和治療對(duì)于CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的更新具有重要意義。

由于本研究樣本量較小，我們的研究假設(shè)仍需要大樣本的研究進(jìn)一步證實(shí)。同時(shí)，增加一組單純?cè)缙陔[性梅毒可能會(huì)更全面的說(shuō)明本文結(jié)論。另外，Caspase可能僅是T淋巴細(xì)胞程序性死亡通路的一個(gè)效應(yīng)分子，梅毒螺旋體是否會(huì)通過(guò)其它途徑影響HIV感染者CD4/CD8+T淋巴細(xì)胞的更新仍需要進(jìn)一步研究，還需將不同分期的早期梅毒納入研究，進(jìn)一步觀察梅毒在不同的感染階段對(duì)CD4/CD8+T淋巴細(xì)胞更新的影響。