p16/Ki-67細胞學雙染檢測在宮頸癌篩查中的應用價值

陳小燕，韓春艷，王紅霞

深圳市南山區婦幼保健院婦女保健科，廣東深圳518000

宮頸癌的癌前病變持續時間較長，早期篩查可及時發現癌前病變和早期浸潤癌，從而達到預防和減少宮頸癌發生的目的[1]。目前，常用的宮頸癌初篩手段包括液基細胞學(TCT)檢測和高危人乳頭瘤病毒(HR-HPV)篩查等[2-3]。對于宮頸細胞學檢查提示的未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細胞(ASC-US)和低級別鱗狀上皮內病變(LSIL)，可采用HR-HPV篩查進行分流，但仍有高級別子宮頸病變漏診的情況發生[4]。

p16是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，目前已被證實其在HR-HPV感染中高度表達，被認為是宮頸癌前病變的替代標志物[5]。Ki-67是一種核抗原和細胞增殖標志物，在除G0外的所有細胞周期中表達。正常細胞中，p16和Ki-67的表達是互斥的，同時檢測細胞中p16、Ki-67的表達可提早預測細胞周期失調以及可能癌變的HR-HPV感染[6]。本研究對行宮頸癌篩查的400例患者進行p16/Ki-67雙染色檢測，通過與其他檢查手段比較，旨在探討p16/Ki-67細胞學雙染檢測在宮頸癌篩查中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019年1～12月在深圳市南山區婦幼保健院進行宮頸癌篩查的400例社區居民作為研究對象。納入標準：(1)均在我院順利完成高危型HPV(HR-HPV)篩查、液基細胞學(TCT)檢測和p16/Ki-67雙染色檢測；(2)組織病理學結果明確；(3)均有性生活史。排除標準：(1)既往有宮頸癌或宮頸局部不明腫瘤史者；(2)具有宮頸局部切除史或放療、化療治療史者；(3)手術子宮切除者，剩余液基細胞不符合樣本制作要求者；(4)合并自身免疫性疾病或口服免疫抑制劑者。體檢婦女年齡22～63歲，平均(42.28±5.52)歲。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有受檢者均知情并簽署同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 HR-HPV篩查所有受檢者采集液基細胞學(TCT)檢測標本進行相關檢測，采用特質毛刷從宮頸中順時針旋轉5圈后裝入Digene樣本保存液中保存，未絕經者于月經中期取樣，檢查前3 d未進行陰道沖洗，并禁止性生活。采集的TCT檢測標本中取1 mL，采用Cobas HPV檢測法(美國Roche Molecular Systems公司)進行HR-HPV檢測和基因分型，Cobas HPV檢測采用自動制樣和實時PCR技術對14種HR-HPV基因型進行檢測，包括HPV-16、HPV-18以及其他12種亞型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)。

1.2.2 TCT檢測采用Thinprep 2000系統(美國Hologic公司)制備薄層細胞涂片，將細胞學涂片固定于95%乙醇溶液中30 min后進行巴氏染色，由兩名婦科細胞病理學專業醫生采用雙盲法進行閱片，細胞學結果分為[7]：(1)良性反應性細胞改變(NILM)；(2)意義不明確的不典型鱗狀上皮細胞(ASC-US)；(3)低級別宮頸鱗狀上皮內病變(LSIL)；(4)高級別宮頸鱗狀上皮內病變(HSIL)；(5)宮頸鱗狀細胞癌(SCC)；(6)意義不明確的非典型腺細胞(AGUS)和腺癌(ACC)。

1.2.3 p16/Ki-67雙染色檢測采用羅氏公司的Ventana Benchmark XT型全自動免疫組織化學染色儀對所有患者的TCT檢測樣本進行p16、Ki-67染色，試劑盒購自羅氏公司抗p16(E6H4)/Ki-67(274-11AC3)單克隆抗體試劑。取TCT檢測樣本進行常規制片、乙醇固定后晾干備用，一抗孵育，過氧化物酶多聚體結合，染色結束后去除切片，洗凈后自然晾干、封固并進行觀察。P16信號表達在細胞核和細胞質上，顯紅色；Ki-67信號表達在細胞核上，顯棕黃色。兩者均染色交叉部分細胞核呈棕褐色，為陽性；單獨顯色或不顯色為陰性(圖1)。

圖1 p16/Ki-67雙染色檢測結果(×200)

1.2.4 組織病理學在陰道鏡檢查術中取受檢者宮頸活組織標本，對其進行固定、常規脫水、包埋和切片操作后進行蘇木精-伊紅(HE)染色。由兩名病理資深醫師進行獨立閱片，根據上皮病變及宮頸癌診斷標準，將CIN2、CIN3、鱗狀細胞癌和腺癌歸為CIN2及以上病變(CIN2+)，其余為CIN2以下病變(CIN2-)。

1.3 統計學方法應用SPSS21.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率(%)形式表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同檢查方式檢出CIN2+病變的診斷效能p16/Ki-67雙染色在檢出CIN2+病變上的敏感度、陰性預測值均明顯高于TCT檢測，特異度、陽性預測值及陰性預測值均明顯高于HR-HPV篩查，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.2 p16/Ki-67雙 染 色、HR-HPV篩 查 檢 出ASC-US、LSIL的敏感度、特異度比較p16/Ki-67雙染色檢出ASC-US、LSIL的敏感度明顯高于HR-HPV篩查，而檢出ASC-US的特異度明顯低于HR-HPV篩查，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表1 不同檢查方式檢出CIN2+病變的診斷效能比較(%)

表2 p16/Ki-67雙染色、HR-HPV篩查檢出ASC-US、LSIL的敏感度、特異度比較(%)

2.3 不同檢查方式檢出HR-HPV陽性患者中CIN2+患者的診斷效能p16/Ki-67雙染色檢出HR-HPV陽性患者中CIN2+患者的敏感度、陰性預測值明顯高于TCT檢測和HPV16/18檢測，其特異度明顯低于HPV16/18檢測，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同檢查方式檢出HR-HPV陽性患者中CIN2+患者的診斷效能比較(%)

3 討論

宮頸癌的癌變過程是一個長時間、連續發展的過程，初始階段通常無特殊癥狀[8]。及早發現、治療宮頸癌前病變是預防宮頸癌發生、發展的重要手段。目前，宮頸癌篩查以TCT和HR-HPV檢測為主。臨床實踐中發現，TCT檢測存在假陰性率偏高，質量控制不佳等問題[9]。TCT檢測結果中的ASC-US和LSIL，病理結果提示異常的鱗狀上皮細胞已超過反應性改變，但嚴重程度上又不足以診斷為CIN2+，5年內仍有轉變為CIN2+的風險[10-11]。對于該類患者，臨床上采用定期隨訪、HR-HPV檢測分流或陰道鏡活檢進行處理。與TCT檢測相比，HR-HPV檢測具有更高的敏感度和客觀性，但其特異度較低；反復定期隨訪容易使患者產生不必要的緊張情緒和過度的跟蹤隨訪；陰道鏡則屬于有創檢查。因此，尋找一種方便快捷、特異度較高的檢測手段用于宮頸癌篩查極為必要[12]。

p16是細胞周期依賴性激酶抑制蛋白，能夠直接抑制細胞周期紊亂，介導細胞的無限制增生，被用于多種惡性腫瘤細胞增殖、轉移的評估中[13]。Ki-67是增殖性細胞核抗原，僅在G0期表達缺失，也被用于多種惡性腫瘤的預后評估[14]。在生理機能正常的細胞中，p16、Ki-67相互拮抗，若兩者在同一細胞中均有表達，代表細胞周期失調，預示著高級別病變的可能[15]。p16/Ki-67雙染色能夠幫助檢出真正的病變細胞，且不依賴于形態學檢測。

本研究以病理學結果為“金標準”，對p16/Ki-67雙染色檢測結果的可靠性和在宮頸癌篩查中的應用可行性進行驗證。結果顯示，p16/Ki-67雙染色在檢出CIN2+病變上的敏感度、陰性預測值(分別為70.00%、82.76%)高于TCT檢測(分別為70.00%、82.76%)，p16/Ki-67雙染色在檢出CIN2+病變上的特異度、陽性預測值及陰性預測值分別為43.33%、34.87%和93.53%，均明顯高于HR-HPV篩查(分別為7.00%、25.60%、84.00%)。p16/Ki-67雙染色在檢出宮頸高級別上皮內病變的敏感度高于TCT檢測，與HR-HPV篩查接近，但其特異性明顯高于HR-HPV篩查。

另外，在檢出HR-HPV陽性患者中CIN2+患者上，p16/Ki-67雙染色的敏感度、陰性預測值(分別為91.67%、93.75%)均明顯高于TCT檢測(分別為69.79%、82.74%)和HPV16/18檢測(分別為48.96%、79.50%)，其特異度(42.86%)明顯低于HPV16/18檢測(67.86%)，差異有統計學意義(P＜0.05)。結果表明，在HR-HPV患者的篩查管理中，p16/Ki-67雙染色與細胞學篩查相比可提高靈敏度和特異性[16]，減少誤診、漏診等情況發生。

在診斷ASC-US、LSIL上，p16/Ki-67雙染色的敏感度分別為59.62%、48.39%，均明顯高于HR-HPV篩查(分別為11.54%、10.75%)，p16/Ki-67雙染色在檢出ASC-US的特異度(66.09%)明顯低于HR-HPV篩查(93.97%)。上述結果提示，p16/Ki-67雙染色在診斷ASC-US、LSIL的敏感度高于HR-HPV篩查，將p16/Ki-67雙染色用于宮頸高級別病變的鑒別診斷中，能夠使分流至陰道鏡檢查、宮頸活檢等創傷性檢查的患者大大減少，可避免過度診斷和治療[17]。

綜上所述，p16、Ki-67是宮頸腫瘤發生、發展的重要生物學標志物指標，p16/Ki-67雙染色在鑒別診斷高級別宮頸上皮病變上具有較高的診斷準確率，能夠較為準確地對ASC-US、LSIL患者進行分流，值得在臨床上推廣應用。