血清microRNA-9-5p在乳腺癌患者臨床診斷中的應用

黃少浩，鄒惠英，羅均勝，招雄民

中山市黃圃人民醫院病理科1、外二科2，廣東中山528429

乳腺癌(breast cancer)是一種臨床常見的女性惡性腫瘤，病因復雜，與乳腺癌的家族史、絕經時間等有關，發病率占女性惡性腫瘤的第一位，早期發現和治療提高預后的關鍵[1]。目前，乳腺癌患者主要通過CT、超聲、MRI等影像學檢查技術聯合常規血清腫瘤標志物進行臨床篩查和診斷，具有良好的檢出效果[2-3]。臨床常用的乳腺癌腫瘤標志物包括血清糖類抗原153(carbohydrate antigen 153，CA153)、CA125、癌 胚 抗 原(carcino-embryonic antigen，CEA)等，在復發轉移乳腺癌的診斷中具有良好的應用效果，但其早期檢出率仍有待提高[4]。尋找新的特異性的血清腫瘤標志物，提高乳腺癌的早期檢出率，具有重要的臨床意義。microRNA-9屬于miRNA家族成員，參與調控胃癌、結直腸癌、宮頸癌等多種腫瘤的發生發展[5-6]。近年來研究顯示，microRNA-9在乳腺癌患者中具有雙向調節作用[7-8]，早期可以抑制乳腺癌的發生，中晚期可以促進乳腺癌的復發和轉移，可以用于乳腺癌的預后評估。但microRNA-9在乳腺癌患者血清中的水平變化分析較少，對乳腺癌的診斷價值尚不清楚。因此，本研究檢查了血清microRNA-9-5p在乳腺癌患者中的水平變化，并對比分析了其在乳腺癌診斷中的應用價值，以期為其早期診斷提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年1月至2019年12月中山市黃圃人民醫院收治的96例乳腺癌患者納入乳腺癌組。納入標準：均經影像學及病理組織學活檢確診為乳腺癌；年齡30～75歲，能積極配合檢查，均獲得本人及家屬的知情同意。排除標準：合并嚴重感染者；存在其他系統惡性腫瘤者；存在免疫系統疾病者；處于妊娠期或哺乳期患者；存在嚴重心腦血管系統、血液系統疾病者；存在嚴重肝、腎功能異常者。以本院同期收治的96例乳腺良性疾病患者納入乳腺良性疾病組。納入標準：均經影像學或病理組織學檢測為乳腺良性疾病患者，年齡30～75歲，能積極配合檢查，均獲得其本人及家屬的知情同意。排除標準同乳腺癌組。以同期96例在我院健康體檢的女性作為對照組。納入標準：均經健康體檢各指標在正常范圍內者，年齡30～75歲，能積極配合檢查，均獲得其本人及家屬的知情同意。排除標準同乳腺癌組。乳腺癌組患者年齡30～75歲，平均(51.82±9.76)歲；根據TNM分期[9]：Ⅰ期27例，Ⅱ期43例，Ⅲ期21例，Ⅳ期5例。乳腺良性疾病組患者年齡30～75歲，平均(51.42±9.77)歲；疾病類型：乳腺纖維腺瘤43例，乳腺小葉增生27例，乳腺囊腫19例，乳腺炎7例。對照組受檢者年齡30～75歲，平均(51.54±9.82)歲。三組受檢者的年齡比較差異無統計學意義(F=0.042，P＞0.05)。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 觀察指標與檢測方法于入組第2天清晨，采集受檢者的空腹靜脈血液3～5 mL，離心(3 500 r/min，10 min)，分離血清，置于-20℃冰箱暫存。采用化學發光免疫分析法(羅氏Cobas e602化學發光儀,德國Roche公司)檢測所有血清樣本中CA153、CA125、CEA水平，嚴格按操作說明進行操作。采用實時熒光qPCR法檢測血清microRNA-9-5p水平，先經miRNeasyMini Kit試劑盒提取血清總RNA，經反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，進行qPCR反應(7500 RT-PCR系統，美國Applied Biosystems公司)，上游引物為：5'-CAACCTTGAGAACTGAATTCCATA-3'，下游引物為：5'-AAAGGTTGATCTCGTCTCTCTGTC-3'，以U6為內參，qPCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40個循環，采用2-△CCT計算相對表達量。

1.3 統計學方法采用SPSS17.0軟件對所得數據進行分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差(x-±s)表示，采用單因素方差分析比較三組間差異，SNK-q比較三組兩兩間差異；Pearson相關性分析血清microRNA-9-5p和傳統腫瘤標志物與乳腺癌患者臨床分期之間的相關性；采用受試者工作特征曲線(ROC)分析血清microRNA-9-5p和傳統腫瘤標志物對乳腺癌的診斷價值，聯合診斷采用Logistic回歸分析建模得到聯合預測概率，曲線下面積(AUC)表示預測價值，檢驗水準α=0.05。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組受檢者的血清microRNA-9-5p水平比較乳腺癌組患者的血清microRNA-9-5p水平明顯高于乳腺良性疾病組和對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，而乳腺良性疾病組患者的血清microRNA-9-5p水平與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 三組受檢者的血清microRNA-9-5p水平比較(±s)

表1 三組受檢者的血清microRNA-9-5p水平比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與乳腺良性疾病組相比較，bP＜0.05。

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表2 三組受檢者血清腫瘤標志物水平比較(±s)

表2 三組受檢者血清腫瘤標志物水平比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與乳腺良性疾病組相比較，bP＜0.05。

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2.2 三組受檢者的血清腫瘤標志物水平比較乳腺癌組患者的血清CA153、CA125、CEA水平明顯高于乳腺良性疾病組和對照組，乳腺良性疾病組患者的血清CA153和CA125水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 不同臨床分期乳腺癌患者的血清microRNA-9-5p和腫瘤標志物水平比較Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者的血清microRNA-9-5p、CA153和CA125水平明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期，Ⅱ期乳腺癌患者的血清microRNA-9-5p和CA153水平明顯高于Ⅰ期，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

2.4 血清microRNA-9-5p和腫瘤標志物與乳腺癌患者臨床分期的相關性首先進行變量賦值，Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3，Ⅳ期=4。Pearson相關性分析顯示，乳腺癌組患者的血清microRNA-9-5p和CA153水平與患者的臨床分期具有顯著的相關性(P＜0.05)，見表4。

表3 不同臨床分期乳腺癌患者的血清microRNA-9-5p和腫瘤標志物水平比較(±s)

表3 不同臨床分期乳腺癌患者的血清microRNA-9-5p和腫瘤標志物水平比較(±s)

注：與Ⅰ期乳腺癌患者比較，aP＜0.05；與Ⅱ期乳腺癌患者比較，bP＜0.05。

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表4 血清microRNA-9-5p和腫瘤標志物與乳腺癌患者臨床分期的相關性

2.5 血清microRNA-9-5p和腫瘤標志物診斷乳腺癌的價值血清microRNA-9-5p診斷乳腺癌的AUC為0.735，血清CA153、CA125、CEA診斷乳腺癌的AUC依 次 為0.832、0.775和0.724；血 清microRNA-9-5p聯合CA153、CA125、CEA診斷 乳 腺 癌的AUC為0.936，見圖1和表5。

圖1 血清microRNA-9-5p和腫瘤標志物診斷乳腺癌的ROC曲線

表5 血清microRNA-9-5和腫瘤標志物診斷乳腺癌的ROC特征

3 討論

乳腺癌患者早期通常不表現明顯癥狀，臨床主要依賴影像學檢查輔助血清學檢測進行篩查和診斷，但對于早期乳腺癌的診斷仍存在一定的局限性[10]。microRNA-9-5p是一類具有多種調控作用的單鏈非編碼miRNA，廣泛分布于各種屬動物，可以與靶mRNA的3'-UTR結合，調節細胞內的多條重要信號通路[11]。目前，microRNA-9-5p在乳腺癌中的調控作用仍存在爭議，部分研究認為microRNA-9-5p可以靶向負調節Ecadherin的表達，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移，推進腫瘤的惡性進展[12]。然而部分研究認為，microRNA-9-5p可以調節TUG1的表達，抑制MCF-7細胞的增殖，促進其凋亡[13]。本研究檢測了乳腺癌患者血清中microRNA-9-5p水平變化，發現乳腺癌患者血清microRNA-9-5p、CA153、CA125和CEA水平明顯高于乳腺良性疾病患者和健康人群。CA153、CA125和CEA均為臨床常用的診斷乳腺癌的血清腫瘤標識物，在乳腺癌中存在異常高表達，常用于乳腺癌的診斷和早期篩查[14]，本研究與其基本類似，提示CA153、CA125和CEA均可用于乳腺癌的早期診斷。徐靜等[15]的研究顯示，乳腺癌患者血清microRNA-9-5p水平明顯升高，對乳腺癌具有一定的診斷價值，本研究結果與其部分一致，提示血清microRNA-9-5p水平變化與乳腺癌的疾病進展有關，可能通過調節腫瘤相關信號通路表達，參與乳腺癌的發生發展，有望應用于臨床診斷。

本研究中，血清microRNA-9-5p和CA153與乳腺癌患者的TNM分期具有顯著的相關性，臨床分期越嚴重，血清microRNA-9-5p和CA153水平越高。TNM分期是國際上通用的乳腺癌臨床分期指南，可以指導乳腺癌患者臨床診療工作的進行，評估患者的預后[16]，提示血清microRNA-9-5p水平與乳腺癌患者的預后有關。CUI等[17]的研究顯示，食管鱗狀細胞癌患者血漿中microRNA-9水平明顯升高，可作為診斷和預測因子用于食管鱗狀細胞癌的診斷和預后生存評估，提示血清microRNA-9-5p水平有望應用于乳腺癌患者的臨床診斷和預后評估。本研究中，血清microRNA-9-5p與CA153、CA125和CEA均對乳腺癌具有一定的診斷價值，其中CA153的診斷價值明顯高于microRNA-9-5p、CA125和CEA單獨診斷，分析原因可能是由于血清microRNA-9-5p在不同分期乳腺癌患者中的水平差異較大，不適用于臨床單獨診斷。已有研究顯示，腫瘤標志物的聯合檢測可以明顯提高臨床診斷的敏感度和特異性，提高診斷價值[18]。本研究分析了血清microRNA-9-5p聯合傳統血清腫瘤標志物對乳腺癌的診斷價值，發現血清microRNA-9-5p聯合傳統血清腫瘤標志物CA153、CA125、CEA診斷乳腺癌的AUC明顯高于其單獨診斷，提示臨床可選擇聯合檢測血清microRNA-9-5p和傳統血清腫瘤標志物，提示乳腺癌患者的檢出率。

綜上所述，乳腺癌患者血清microRNA-9-5p、CA153、CA125和CEA水平明顯高于乳腺良性疾病患者和健康人群，聯合檢測對乳腺癌具有較高的診斷價值，且血清microRNA-9-5p和CA153與乳腺癌患者的臨床分期具有顯著的相關性，提示臨床可聯合檢測血清microRNA-9-5p和傳統腫瘤標志物用于臨床乳腺癌的診斷篩查和預后評估。本研究不足之處在于樣本數量較少，且僅初步分析了乳腺癌患者血清microRNA-9-5p的水平變化，具體的作用機制尚不明確，有待于臨床深入探索。