潰瘍性結腸炎大鼠中縫隙連接蛋白的表達及分布

劉衛東，馮燕，惠文佳，王春，司軍強，高峰

1.新疆維吾爾自治區人民醫院消化科，新疆烏魯木齊830001；

2.新疆維吾爾自治區人民醫院病理科，新疆烏魯木齊830001；

3.石河子大學醫學院生理教研室，新疆石河子832000

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)的發病與腸黏膜屏障缺陷、遺傳易感性、微生物環境不平衡等多因素共同作用下的腸道免疫功能紊亂有關[1]。機械屏障、化學屏障、免疫屏障與生物屏障的相互作用構成了腸道黏膜屏障。其中機械屏障主要有縫隙連接、緊密連接和黏附連接共同參與，而縫隙連接蛋白對黏膜屏障具有調節作用[2]?？p隙連接通道的基本單位是連接蛋白(connexin，Cx)，連接蛋白在不同的組織和器官中的表達具有特異性，結腸上表達的有Cx26、Cx31、Cx31.1、Cx32、Cx36、Cx40、Cx43、Cx45[3-4]。其中比較重要的縫隙連接蛋白就是Cx43，研究表明它具有腫瘤抑制的特性[5]。Cx32敲除的小鼠中，通過X射線照射發現小鼠總體腫瘤負荷明顯增加，說明連接蛋白表達的缺失與腫瘤發生增加有關[6]。目前，縫隙連接蛋白在潰瘍性結腸炎中的研究較少，且連接蛋白可能作為潰瘍性結腸炎潛在的預測標記物和治療靶點。因此，本研究通過分析Cx43和Cx32在UC大鼠模型中表達和分布差異，初步探討縫隙連接蛋白在UC中的表達意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠30只，6～8周齡，體質量約200 g。大鼠來源于新疆醫科大學實驗動物中心，隨機分為DNBS(2,4-Dinitrobenzene sulfonic acid)誘導模型組15只和對照組15只。本研究中的動物實驗部分通過了新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會審核批準(KY2018011817)。

1.1.2 主要試劑與儀器其中有二硝基苯磺酸(2,4-Dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS)(Sigma公司)；小鼠單克隆Cx32抗體(Abcam公司)；兔多克隆Cx43抗體(Abcam公司)；鼠抗β-actin抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)；RNeasy Mini Kit試劑盒(Qiagen公司)；總蛋白提取試劑盒(Qiagen公司)；CFX96TOuch熒光定量PCR檢測系統(Bio-Rad公司)；LSM510激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss公司)，雙垂直電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNBS誘導的UC大鼠模型及驗證大鼠禁食24 h，用指尖輕輕按壓動物的肛門，去除可能出現在遠端結腸的糞便。模型組采用七氟烷麻醉誘導并維持，使用直徑為0.1 cm、長度為10 cm的聚乙烯導管，隨后使用50%乙醇溶解的DNBS灌注誘導結腸炎，注射劑量為100 mg/kg。模型期間給大鼠正常喂食并飲水使用8%的蔗糖溶液。造模4 d后，采用七氟烷麻醉，頸椎脫臼處死，迅速取出大鼠結腸組織并處理干凈。截取部分大鼠結腸組織使用4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液進行固定，通過免疫組化驗證UC大鼠模型。

1.2.2 Cx32和Cx43 mRNA在結腸組織的表達大鼠結腸組織采用RNeasyMini Kit試劑盒提取結腸組織總RNA，反轉錄合成cDNA。所有cDNA樣品分別配置實時定量PCR反應體系置于實時定量PCR儀上進行擴增反應。Cx32、Cx43和β-actin的擴增引物見表1。本實驗采用β-actin作為內參，每個樣品重復測定3次，通過計算出每個樣品2-△△Ct，得出Cx32、Cx43 mRNA的相對表達量。

表1 各基因引物序列

1.2.3 Cx32和Cx43在結腸組織的分布和表達處理后的大鼠結腸組織置于含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液內固定48 h，冰凍切片，使用3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶后分別加入Cx32和Cx43特異性抗體4℃過夜。次日加入FITC標記相關二抗，按照說明書進行避光操作，使用熒光顯微鏡進行分析蛋白的表達水平和位置分布；Western blot檢測按照試劑盒操作步驟進行組織蛋白提取，用BCA法測定全蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，23 V電轉43 min，5%牛奶封閉非特異性結合位點后，棄去封閉液，分別加入Cx32和Cx43一抗，振蕩孵育4℃過夜。次日取再與辣根過氧化物酶標記的相關二抗室溫孵育，使用化學發光試劑盒處理、顯影、定影，呈像。

1.3 統計學方法實驗數據通過SPSS17.0軟件進行統計分析，計量資料均符合正態分布，以均數±標準差(x-±s)表示，組間兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD方法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物模型的建立及驗證UC大鼠模型組中均出現懶動、拱背、厭食、消瘦、皮毛光澤度下降、大便次數增多、部分出現黏液血便。UC造模前和3 d后比較體質量由(212.5±7.3)g下降至(202.5±10.6)g，差異無統計學意義(t=-2.41，P＞0.05)。每天記錄實驗大鼠疾病活動指數(DAI)評分，即DAI=(體質量下降分數+大便性狀分數+便血情況分數)/3。UC模型組1 d、2 d、3 d的DAI評分分別為(0.79±0.17)分、(1.29±0.27)分、(2.13±0.25)分，呈上升趨勢，差異有顯著統計學意義(F=25.1，P＜0.01)。形態學觀察結腸組織表現為黏膜充血水腫甚至糜爛。大鼠結腸組織形態的病理改變見圖1。對照組大鼠結腸黏膜可見單層柱狀上皮細胞排列整齊，腸腺清晰，吸收細胞與杯狀細胞的形態正常，未見炎性細胞浸潤。DNBS誘導的大鼠模型組結腸黏膜肌層，杯狀細胞出現缺失，隱窩形態不規則，大部分可見潰瘍面，隱窩膿腫形成，嚴重者可見中性粒細胞破壞至平滑肌層。

圖1 對照組和UC模型組中結腸組織病理形態變化

2.2 UC組大鼠中Cx32和Cx43mRNA表達水平比較實時定量PCR檢測Cx32和Cx43 mRNA表達的結果顯示(圖2)：UC模型組中的Cx32和Cx43 mRNA相對表達量較對照組分別提高2.3倍和3.4倍，差異均有統計學意義(t=-5.4、12.3，P＜0.05)。

圖2 UC模型組結腸組織中Cx32和Cx43 mRNA相對表達量

2.3 UC模型大鼠中Cx32和Cx43的表達和分布比較免疫定光分析Cx32和Cx43在UC模型組中的平均熒光密度分別為115.2±4.6、104.6±7.2，高于對照組的106.3±5.7、59.5±4.8，僅Cx43的表達差異有顯著統計學意義(t=-17.8，P＜0.01)。Cx32和Cx43的熒光在細胞質和細胞膜均有分布，UC模型組中Cx32和Cx43的定位顯著向細胞核轉移(圖3)；Western blot結果顯示(圖4)，UC模型組中Cx32蛋白表達量較對照組升高1.2倍，但差異無統計學意義(P＞0.05)；Cx43蛋白相對表達量較對照組顯著升高1.6倍，差異有顯著統計學意義(t=-5.2，P＜0.01)。

圖3 UC組和對照組結腸組織中Cx32和Cx43的表達及分布(200×)

圖4 結腸組織中Cx32和Cx43相對表達量

3 討論

潰瘍性結腸炎屬慢性非特異性炎癥性疾病，病情反復發作、遷延不愈，伴隨多種腸外表現，且具有癌變的傾向，嚴重影響患者的生活質量[7]。目前，潰瘍性結腸炎是慢性腹瀉的主要病因，其發病機制可能與腸黏膜屏障缺陷、遺傳易感人群在腸道持續感染以及環境改變等多因素作用下發生腸道免疫功能紊亂有關[8]。以細胞間縫隙連接為途徑進行細胞間直接的信息交流與腸黏膜屏障功能的缺陷和免疫功能紊亂密切相關。免疫組化提示大量淋巴細胞浸潤，杯狀細胞丟失，隱窩膿腫形成。腸黏膜屏障是UC發生發展過程中的重要因素，是調控機體應激反應、生成炎癥介質的重要器官?？p隙連接蛋白在多種炎癥及腫瘤發展的不同階段存在表達水平的差異，并能與體內細胞周期或腫瘤形成相關的蛋白發生相互作用，參與免疫調節[9]。

縫隙連接通道是由相鄰的兩個細胞通過特殊的細胞膜蛋白結構相互作用連接形成的通路，構成縫隙連接的基本單位是連接蛋白(connexin，Cx)。目前，在人類中已發現超過20種的連接蛋白，細胞膜上每6個連接蛋白亞基聚合形成一個半通道，細胞間的兩個半通道形成兼容且有功能的縫隙連接通道是通過半通道亞基中的氫鍵相互錨定形成的[10]?？p隙連接通道可以允許相對分子質量小于1 kD的小分子物質自由通過，包括ATP、cAMP、IP3和離子。細胞之間通過縫隙連接蛋白形成一個低電阻通道進行信息、能量和物質的交換，參與細胞間物質交換的代謝偶聯和電信號傳遞的電偶聯，對細胞和組織的新陳代謝、內環境穩態、增殖和分化等生理過程具有重要的調節作用[11]。

本研究發現在潰瘍性結腸炎大鼠中Cx32和Cx43蛋白和mRNA的表達增高，縫隙連接蛋白表達的增高可能參與炎癥反應過程，尤其是Cx43可能具有重要的調節作用。眾多結果表明，縫隙連接在結直腸腫瘤的疾病進展中具有著重要的作用。在人類的腸上皮細胞和黏膜肌層中，Cx43表達比較豐富，研究表明結直腸癌發展過程與縫隙連接蛋白的功能缺失和細胞質膜上的功能再定位有關[12-13]，結腸癌樣本中，Cx43的表達較對照組顯著下調75%，且與組織型和腫瘤侵潤型癌顯著相關，其表達具有腫瘤抑制的特性[14]。此外，已有的研究也表明Cx43的表達可能是通過干預Wnt/β-catenin通路抑制結腸癌細胞的生長[15]。Wnt/β-catenin通路在腸道生理學中具有形成上皮內穩態的作用，是腸上皮干細胞識別和維持的組織者。Wnt/β-catenin通路不僅能調控胚胎發育，也對腸道自我更新具有重要的調節作用，過度活化的Wnt信號通路是UC相關結直腸癌發生發展的關鍵事件[16-17]。從功能上講，Wnt激活可增加體內大鼠皮膚中傷口再上皮的速率。已有研究表明Wnt信號通路的激活可以促進TNBS處理的小鼠的黏膜修復，而Wnt激動劑處理的細胞中Cx43的核定位增加了8～10倍[13，18]。免疫熒光提示Cx32和Cx43蛋白表達量增高，并有核轉移現象，UC特征在于黏膜下水平的慢性炎癥和上皮屏障功能的破壞。本研究提示Wnt信號通路可能通過調節連接蛋白參與潰瘍性結腸炎腸黏膜的修復，縫隙連接可以介導腸道免疫細胞與腸上皮細胞之間的異型縫隙連接通訊，通過腸道炎癥細胞和上皮細胞建立細胞連接的復合體，從而可以易化腸黏膜屏障功能的缺陷[19]?？p隙連接蛋白在潰瘍性結腸炎中的研究較少，而縫隙連接蛋白在UC中調節機制有待進一步研究。

綜上所述，縫隙連接是細胞間重要通訊方式，且連接蛋白可能作為潰瘍性結腸炎潛在的預測標記物和治療靶點。DNBS誘導的UC大鼠模型中，Cx32和Cx43參與UC的炎癥過程，尤其是Cx43在UC的疾病過程中可能具有重要的作用。