冷凍切片固定質量影響因素的探討

鄭捷 方慶全 高德宏

冷凍切片固定質量影響因素的探討

鄭捷 方慶全 高德宏

目的探討影響冰凍切片固定質量的因素。方法收集2016年1—12月廈門大學附屬第一醫院病理科的80例冷凍切片標本，每例標本連續切片7片，隨機分為7組，A組電吹風快速吹干切片，B組立即放入95%乙醇固定1 min，C組立即放入10%中性福爾馬林固定1 min，D組立即放入丙酮固定1 min，E組立即放入AAF液固定1 min，M組立即放入AAF液固定15 s，N組立即放入AAF液固定30 s。固定后染蘇木素、水洗、分化、返藍、染伊紅、脫水、透明、封固等，比較各組的脫片情況、染色結果。結果A組未發現脫片現象，B、C、D、E組出現脫片的數量分別為15片、12片、24片和13片。將B組未脫片的65例編成F組，將C組未脫片的68例編為G組，將D組未脫片的56例編為H組，將E組未脫片的67例編為I組，比較A、F、G、H、I五組染色情況，I組組織清晰的切片比例明顯高于A、F、G和H組（P均＜0．05）；在細胞皺縮度方面，與I組比較，F組、H組細胞均出現明顯皺縮現象（P均＜0．01）；I組的細胞核染色鮮艷度和核漿對比度均明顯優于其他四組（P均＜0．05）。比較 M、N和I組的染色情況，染色效果從優到劣依次為I組→N組→M組。結論AAF是一種較為理想的冰凍切片固定液；影響冰凍切片固定質量的因素包括固定液的種類、冷凍組織的類別、固定時間的長短等。

冷凍切片；固定；質量；影響因素

快速將組織冷凍成一定的硬度，切出薄片的過程，稱冷凍切片[1]。冷凍切片技術在病理診斷中具有舉足輕重的作用[2-3]，常用于臨床手術科室快速組織學診斷，在手術進行當中取出病變組織，要求病理醫師在很短的時間內做出良、惡性的診斷，為臨床醫師下一步的手術方案與治療提供指導[4]。因此，制作一張高質量的冷凍切片對術中病理診斷極其重要，而固定是其中非常關鍵的環節。作者通過對比實驗，探討冷凍切片固定質量的影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2016年1—12月廈門大學附屬第一醫院病理科的80例冷凍切片標本，其中乳腺組織35例、甲狀腺組織25例、肺組織5例、卵巢組織10例、淋巴結5例。

1.2 設備

冷凍切片機為德國Microm HM525冷凍切片機。

1.3 試劑

新配制的Harri蘇木素染液，95%乙醇，10%中性福爾馬林，丙酮，AAF液（由95%乙醇A：乙酸A：甲醛F = 85：5：10組成）。

1.4 取材與切片

按常規取材、速凍、冷凍切片[1]，每例連續切片7片，隨機組成7組切片。

1.5 固定

7組冷凍切片分別按以下方法處理：A組：電吹風快速吹干切片，B組：立即放入95%乙醇固定1 min，C組：立即放入10%中性福爾馬林固定1 min，D組：立即放入丙酮固定1 min，E組：立即放入AAF液固定1 min，M組：立即放入AAF液固定15 s，N組：立即放入AAF液固定30 s。

1.6 染色

切片固定（A組電吹風快速吹干）后放入已預熱的蘇木素中染色1 min，水洗、分化、返藍、染伊紅、脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察。

1.7 觀察指標

以組織清晰度、細胞皺縮度、細胞核染色、核漿對比度四項為評價指標，顯微鏡下觀察比較不同固定方法下冷凍切片的染色效果。

1.8 統計學分析

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用百分率（%）表示，行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脫片情況比較

A組未發現脫片現象，B、C、D、E四組均出現不同程度的組織脫片。B、C、D、E組出現脫片的數量分別為15片、12片、24片和13片。

2.2 染色結果比較

將B組未脫片的65例編成F組，將C組未脫片的68例編為G組，將D組未脫片的56例編為H組，將E組未脫片的67例編為I組，比較A、F、G、H、I五組染色情況見表1。

表1 5種不同固定液固定下冷凍切片HE染色結果（n / %）

由表1可見，I組組織清晰的切片比例明顯高于A、F、G和H組（χ2= 6.45、4.06、5.25、17.46，P均＜0.05）。在細胞皺縮度方面，與I組比較，F組、H組細胞均出現明顯皺縮現象（χ2=27.00、34.68，P均＜0.01）。I組的細胞核染色鮮艷度和核漿對比度均明顯優于其他四組（χ2=8.84、5.30、6.63、16.50，5.43、4.34、5.40、13.73，P均＜0.05）。

2.3 固定時間長短比較

比較 M、N和I組的染色情況，M組：五種組織均結構模糊，細胞核腫大，細胞核染色差，核漿對比度差。N組：乳腺、肺、卵巢三種組織固定效果較 M組明顯改善，甲狀腺、淋巴結組織無改善。I組：五種組織固定效果均佳。

3 討論

隨著醫學技術的發展，冷凍切片得到了廣泛應用[5-6]。冰凍切片由快速切片、快速固定、快速染色三部分組成[7]，在短時間內制作一張高質量的切片要注意的細節很多，固定質量的好壞對切片質量有極大的影響。

固定液的選擇很大程度上影響固定的質量。常用的固定液有95%乙醇、10%福爾馬林、丙酮、AAF液等。朱小蘭等[8]發現，95%乙醇屬沉淀類固定劑，對組織脫水、收縮作用明顯，使細胞核保存不夠清晰，核著色不良，細胞會出現明顯皺縮現象。10%福爾馬林對組織具有較強的穿透能力，對組織無明顯收縮作用，但無法消除因冷凍引起的細胞內液的腫脹，因此染色易導致細胞核模糊、對比度不佳。而且甲醛固定需要 10 min 以上，影響冷凍切片的出片速度[9]。丙酮是易燃易揮發氣體，滲透力強，但對肝、腎組織固定效果欠佳，常被誤診為組織自溶，且丙酮固定使組織收縮劇烈，易脫片。AAF液是一種復合型固定液，其中乙醇、甲醛有較好的固定作用，而乙酸能使組織膨脹，可抵償因乙醇、甲醛固定引起的組織收縮和硬化，三種固定液的混合使用固定效果達到最佳。另一影響固定質量的因素是放入固定液中的固定時間。以AAF液為例，放置1 min組織固定效果比放置15 s、30 s更好。

綜上所述，AAF是一種較為理想的冰凍切片固定液，影響冰凍切片固定質量的因素包括固定液的種類、冷凍組織的類別、固定時間的長短等。

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[3] 張海?。?甲狀腺微小乳頭狀癌的術中冰凍病理診斷分析[J]． 中國衛生標準管理，2016，7（36）：159-161．

[4] 王德田，董建強． 實用現代病理學技術[M]． 北京：中國協和醫科大學出版社，2013：80．

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[6] Sala P，Morotti M，Menada MV，et a1．Intraoperative frozen section risk assessment accurately tailors the surgical staging in patients affected by early-stage endometrial cancer：the application of 2 different risk algorithms[J]．Int J Gynecol Cancer，2014，24（6）：1021-1026．

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如何編寫參考文獻

列出參考文獻的目的，在于引證資料（包括觀點、方法等）的來源，不可從別人的論文中轉抄過來。內部資料，非經正式發表者，一般不作文獻引用，要求引用文獻者必須用閱讀過的、重要的、近5年文獻為準。論著10條左右，論著摘要3～5條，綜述20條左右。

Discussion on the Factors Influencing the Fixation Quality of Frozen Section

ZHENG Jie FANG Qingquan GAO Dehong Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen Fujian 361003,China

ObjectiveTo investigate the factors affecting the fixation quality of frozen section.Methods80 cases of frozen sections from the First Affiliated Hospital of Xiamen University were collected from January to December 2016. Each specimen was serially sectioned into 7 slices, randomly divided into 7 groups: A group, quickly drying slice with hair dryer. B group, immediately placed in 95% ethanol to fix 1 min. C group, immediately placed in 10% neutral formalin to fix 1 min. D group,immediately placed in acetone to fix 1 min. E group, immediately placed in the AAF liquid to fix 1 min. M group, immediately placed in the AAF liquid to fix 15 seconds. N group, immediately placed in AAF liquid to fix 30 seconds. After fixation, the process of dyeing hematoxylin, washing,differentiation, returning blue, dyeing eosin, dehydration, transparency,sealing and so on, were carried out according with the unified procedure.The results of the unfalling and staining of each group were compared.ResultsNo stripping was found in the A group. The number of stripping in B, C, D and E group was respectively 15, 12, 24 and 13. 65 cases of no stripping in B group were incorporated into F group. 68 cases of no stripping in C group were incorporated into G group. 56 cases of no stripping in D group were incorporated into H group. 67 cases of no stripping in E group were incorporated into I group. The staining of five groups of A, F, G, H and I were compared. The number of clear tissue slices in I group was significantly higher than that of A, F, G and H group (P ＜0.05); In the aspect of cell shrinkage, compared with I group, the cells in F group and H group showed obvious shrinkage phenomenon (P ＜ 0.01);The nuclear staining brightness and contrast caryoplasm in I group were significantly better than the other four groups (P ＜ 0.05). The staining of M,N and I group was compared, the dyeing effect from priority to inferiority were I group, N group and M group.ConclusionAAF is an ideal fixation fluid for frozen section. The factors affecting the quality of frozen section include the types of the fixation liquid, the types of frozen tissue, the length of the fixation and so on.

frozen section; fixation; quality; influencing factor

R365

A

1674-9316（2017）22-0127-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．22．063

廈門大學附屬第一醫院病理科，福建 廈門 361003

方慶全