不同處理對(duì)梨酵素抗氧化活性的影響

◎ 吳 慧，馬雙雙

（商丘學(xué)院，河南 商丘 476000）

酥梨是我國(guó)主要栽培的梨品種之一，而河南省寧陵縣是酥梨的集中生產(chǎn)區(qū)，其金頂謝花酥梨有著極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有人體所需的鐵、磷等礦物質(zhì)及維生素C。另外，還具有很高的藥用價(jià)值，例如，具有清熱止咳、祛痰理脾、醒酒解毒等藥效。在我國(guó)，梨以鮮食為主，加工產(chǎn)品較少，高附加值產(chǎn)品更少。酵素的制備可以提高梨的附加值，實(shí)現(xiàn)梨的深加工，不僅幫助梨農(nóng)解決成熟季節(jié)梨的滯銷(xiāo)問(wèn)題，還能使梨的生產(chǎn)形成產(chǎn)業(yè)化。同時(shí)，還能吸納農(nóng)村剩余勞動(dòng)力，促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)和區(qū)域性高效農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展，實(shí)現(xiàn)農(nóng)民增收，農(nóng)業(yè)增效，從根本上緩解“三農(nóng)”問(wèn)題。

本試驗(yàn)以寧陵金頂謝花酥梨為原料，對(duì)比切丁和打漿兩種不同處理下，自然發(fā)酵、菌種發(fā)酵過(guò)程中pH、糖度、多酚、DPPH 自由基清除力、ABTS 自由基清除力及羥基自由基清除力的變化趨勢(shì)，為酵素的制備提供一定的理論基礎(chǔ)及技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

寧陵金頂謝花酥梨、酵母菌、乳酸菌及白砂糖。

1.2 試驗(yàn)試劑

乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、甲醇、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉，所有試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

MJ-160 型霉菌培養(yǎng)箱（上海平軒科學(xué)儀器有限公司）、TDL-80-2B型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、TU-1810 型紫外分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）、WYT4 型手持糖度計(jì)（泉州中友光學(xué)儀器有限公司）、PHB4 型酸度計(jì)（上海雷磁儀器有限公司）、XMTD-204 數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）、PTX-FA210 型電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）以及HR7633 打漿機(jī)（飛利浦家庭電器珠海有限公司）。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 梨酵素的制備

梨酵素制備：原料的選取→清洗→去核→切丁或打漿→滅菌→冷卻→裝罐→加糖→接種→25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵→取清液離心→測(cè)其理化指標(biāo)和抗氧化能力。加糖量6%，自然發(fā)酵不需要滅菌、接種。菌種發(fā)酵時(shí)，酵母菌和乳酸菌提前進(jìn)行活化處理，接種量均為1.5%。一天放一次氣，兩天測(cè)一次指標(biāo)。

1.4.2 還原力的測(cè)定

參考Oyaizu 等[1]的方法，取酵素樣液1 mL 于試管中，依次加入pH=6.6 的K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液 2.5 mL，1% K3[Fe（CN）6]溶液2.5 mL，混勻。于50 ℃ 恒溫水浴中反應(yīng)20 min 后，急速冷卻，加入10%三氯乙酸2.5 mL，迅速搖勻，在4 000 r·min-1離心15 min， 取上清液2.5 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% 的FeCl30.5 mL 和蒸餾水2.5 mL，搖勻，在700 nm 處測(cè)其吸光值，重復(fù)3 次。

1.4.3 DPPH 自由基清除率的測(cè)定

參考Mishra 等[2]的方法，在517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，按式（1）計(jì)算DPPH 自由基清除率（%）。

式中：A0-蒸餾水和DPPH 工作液混合后的吸光值；A1-梨酵素樣液和DPPH 工作液混合后的吸光值；A-不加DPPH 工作液的吸光值。

1.4.4 ABTS 自由基清除率的測(cè)定

參考Re 等[3]的方法，在734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。按式（2）計(jì)算ABTS 自由基清除率（%）。

式中：A0-蒸餾水和ABTS 溶液混合后的吸光值；A1-樣液和ABTS 溶液混合后的吸光值；A-不加ABTS工作液的吸光值。

1.4.5 羥自由基（·OH）清除率的測(cè)定

參考張偉敏等[4]的方法，在510 nm 處測(cè)定吸光值，按式（3）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A0-空白對(duì)照的吸光值；A1-加樣品的吸光 值；A-不加H2O2的吸光值。

1.4.6 多酚含量的測(cè)定

參照Yang 等[5]的Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，波長(zhǎng)765 nm 處吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程計(jì)算樣品中多酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 切丁和打漿處理后梨酵素的pH

切丁處理和打漿處理后，梨酵素的pH 變化如圖1、圖2 所示。打漿處理后梨酵素的pH 略高于切丁處理后的梨酵素。酵母菌發(fā)酵制備的梨酵素pH 要高于自然發(fā)酵和乳酸菌發(fā)酵制備的梨酵素，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，2 種處理和3 種發(fā)酵方式制備的梨酵素pH 均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但總體來(lái)說(shuō)變化幅度不大。

圖1 切丁處理后梨酵素的pH 變化圖

圖2 打漿處理后梨酵素的pH 變化圖

2.2 切丁和打漿處理后梨酵素的糖度

切丁處理和打漿處理后，梨酵素的糖度變化如圖3、圖4 所示。打漿處理后梨酵素的糖度略高于切丁處理后的梨酵素。乳酸菌發(fā)酵制備的梨酵素糖度要高于自然發(fā)酵和酵母菌發(fā)酵制備的梨酵素，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，3 種發(fā)酵方式制備的梨酵素糖度均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

圖4 打漿處理后梨酵素的糖度變化圖

2.3 切丁和打漿處理后梨酵素的還原力

切丁處理和打漿處理后，梨酵素的還原力的變化如圖5、圖6 所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，2 種處理和3 種發(fā)酵方式制備的梨酵素還原力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。切丁處理后，酵母菌發(fā)酵在第8 d 樣液還原力達(dá)到2.40，優(yōu)于自然發(fā)酵和乳酸菌發(fā)酵。打漿處理后，3 種發(fā)酵方式均在第8 d 樣液還原力達(dá)到最大值，自然發(fā)酵制備的梨酵素液還原力略高于菌種發(fā)酵，為2.36。

2.4 切丁和打漿處理后梨酵素的多酚含量

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程為y=0.016 4x+ 0.002 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 9。根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程計(jì)算樣品中多酚含量。梨酵素的多酚含量的變化如圖7、圖8 所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)， 3 種發(fā)酵方式制備的梨酵素多酚含量的變化趨勢(shì)大致相同。從開(kāi)始發(fā)酵到發(fā)酵第8 d，酚類(lèi)物質(zhì)的含量隨著發(fā)酵過(guò)程中有益菌的增加而增多，發(fā)酵第8 d 達(dá)到最高值。其中切丁處理后，利用酵母菌發(fā)酵制備的梨酵素多酚含量最高，可達(dá)到35.57 mg·mL-1。而打漿處理后，利用自然發(fā)酵制備的梨酵素多酚含量最高，可達(dá)到34.81 mg·mL-1。

圖5 切丁處理后梨酵素的還原力變化圖

圖6 打漿處理后梨酵素的還原力變化圖

圖7 切丁處理后梨酵素的多酚含量變化圖

圖8 打漿處理后梨酵素的多酚含量變化圖

2.5 切丁和打漿處理后梨酵素的羥自由基清除率

切丁處理和打漿處理后，梨酵素羥自由基清除率的變化如圖9、圖10 所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)， 2 種處理和3 種發(fā)酵方式制備的梨酵素羥自由基清除率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵第8 d 達(dá)到最大值。切丁處理后，酵母菌發(fā)酵制備的梨酵素羥自由基清除率在8 d 達(dá)90.35%，優(yōu)于乳酸菌發(fā)酵和自然發(fā)酵。打漿處理后，自然發(fā)酵制備的梨酵素羥自由基清除率在8 d 達(dá)88.89%，優(yōu)于酵母菌發(fā)酵和乳酸菌發(fā)酵。

圖9 切丁處理后梨酵素的羥自由基清除率變化圖

圖10 打漿處理后梨酵素的羥自由基清除率變化圖

2.6 切丁和打漿處理后梨酵素的DPPH 自由基清除率

切丁處理和打漿處理后，梨酵素DPPH 基清除率的變化如圖11、圖12 所示。3 種發(fā)酵方式制備的梨酵素DPPH 自由基清除率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵第8 d 時(shí)達(dá)到最高值。切丁處理后，酵母菌發(fā)酵制備的梨酵素DPPH 基清除率達(dá)81.31%，高于乳酸菌發(fā)酵，乳酸菌發(fā)酵高于自然發(fā)酵。打漿處理后，自然發(fā)酵制備的梨酵素DPPH 自由基清除率最高，可達(dá)到80.17%。

圖11 切丁處理后梨酵素的DPPH 自由基清除率變化圖

圖12 打漿處理后梨酵素的DPPH 自由基清除率變化圖

2.7 ABTS 自由基清除率

切丁處理和打漿處理后，梨酵素發(fā)酵過(guò)程中ABTS自由基清除率的變化如圖13、圖14 所示。3 種發(fā)酵方式制備的梨酵素ABTS 自由基清除率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵第8 d 時(shí)達(dá)到最高值。切丁處理后，酵母菌發(fā)酵制備的梨酵素ABTS 自由基清除率略高于另外兩種發(fā)酵方式制備的梨酵素，達(dá)到92.17%。打漿處理后，自然發(fā)酵制備的梨酵素ABTS 自由基清除率較高，達(dá)到91.74%。

圖13 切丁處理后梨酵素的ABTS 自由基清除率變化圖

圖14 打漿處理后梨酵素的ABTS 自由基清除率變化圖

3 結(jié)論

以新鮮的寧陵金頂謝花酥梨為原料，通過(guò)自然發(fā)酵、酵母菌發(fā)酵、乳酸菌發(fā)酵制作梨酵素，對(duì)比切丁處理和打漿處理對(duì)梨酵素發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)和抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，切丁處理后，酵母菌發(fā)酵優(yōu)于自然發(fā)酵和乳酸菌發(fā)酵，梨酵素的還原力為2.40、多酚含量為35.57 mg·mL-1、羥自由基清除率為90.35%、DPPH 自由基清除率為81.31%、ABTS 自由基清除率為92.17%。打漿處理后，自然發(fā)酵要比菌種發(fā)酵效果好，酵素液的還原力為2.36、多酚含量為34.81 mg·mL-1、羥自由基清除率為88.89%、DPPH 自由基清除率為80.17%、ABTS 自由基清除率為91.74%。