活血潛陽祛痰方對肥胖高血壓大鼠心肌氧化應激及炎癥的影響*

蘆 波 謝 君 符德玉 陳曉喆 趙銘一 桂明泰 周訓杰 姚 磊 李建華

（上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437）

近年來，肥胖和嚴重肥胖的患病率持續增長，2017年至2018年成人肥胖率為42.4%［1］，我國肥胖人數高居全球第一［2］，與此同時，高血壓的流行程度也與日俱增［3］。肥胖是心血管疾病的獨立危險因素，可加劇高血壓靶器官損害及其心血管并發癥的病理進程，肥胖高血壓（OBH）相關的心肌重構是亟待解決的衛生問題。本研究觀察活血潛陽祛痰方對OBH大鼠心肌重構的影響，并初步探討該方藥治療OBH的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5周齡SPF級雄性SHR78只，實驗動物合格證號：1100111911038390，雄性WKY6只，實驗動物合格證號：1100111911038391，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。

1.2 實驗藥物

活血潛陽祛痰方由丹參、石決明、川芎、鉤藤、桑寄生、山楂和玉米須組成。按照課題組前期研究，大鼠用量為臨床用量的18倍，委托南京軍區總醫院藥劑科制備浸膏備用，生藥濃度5.98 g/mg。纈沙坦，由諾華制藥公司（北京）生產，產品批號：X2637。

1.3 試劑與儀器

1）試劑：MDA（貨號：A003-1-2）和Mn-SOD生化試劑盒（貨號：A001-2-2）均由南京建成生物工程研究所提供。AngⅡ酶聯免疫試劑盒，上海信裕生物科技有限公司，貨號：xy-E12947；NOX4抗體，abcam公司，貨號：ab133303；NF-κb p65抗體，abcam公司，貨號：ab16502；ERK1/2抗體，CST公司，貨號：4695T；p-ERK1/2抗體，CST公司，貨號：4370T。2）儀器：BIORAD公司電泳儀（型號mini protean 3 cell），大連競邁科技有限公司電轉儀（PS-9），Tanon-5200成像系統，多功能酶標儀（Bio Tek），臺式高速冷凍離心機（Eppen?dorf），芬蘭雷勃MK3型酶標儀，吉爾森Pipetman型移液器，LeicaHI1210型水浴鍋，美國Revco ULT2586-4-V型超低溫冰箱，美國Baker SG403TX/603TX型生物安全柜，德國Leica正置顯微鏡（DM2000），超聲診斷儀（Super Sonic Aixplorer）。

1.4 模型制備

適應性喂養1周后，根據SHR體質量隨機篩選出6只繼續喂養普通飼料（SHR組），余喂養高脂飼料（配方參考文獻［4］改進：普通繁殖飼料60%，豬油12.5%，蔗糖10%，蛋黃粉10%，奶粉5%，膽固醇2%，膽鹽0.5%；委托江蘇美迪森生物醫藥有限公司制作）。10周后，將高脂飼料喂養的SHR中體質量位于上游前1/3的大鼠（n=24）選為OBH大鼠［5］。

1.5 分組與給藥

24只OBH大鼠隨機分為4組，每組6只，藥物干預10周。WKY組予普通飼料+飲用水灌胃；OBH組予高脂飼料+飲用水灌胃；中藥低劑量組予高脂飼料+中藥19.35 g/（kg·d）灌胃；中藥高劑量組予高脂飼料+中藥38.7 g/（kg·d）灌胃；纈沙坦組予高脂飼料+30 mg/（kg·d）纈沙坦灌胃；SHR組予普通飼料+飲用水灌胃。

1.6 觀察指標

1.6.1 心臟超聲 給藥結束后大鼠行脫毛處理，異氟烷吸入麻醉，采用高分辨率小動物超聲儀檢查心臟超聲：左心室舒張末期內徑（LVIDd）、室間隔厚度（IVSd）、左心室后壁厚度（LVPWd），每只大鼠取3個心動周期進行測量，取平均值，自動計算LVM-cor。每組檢測3只。

1.6.2 血液標本取材 給藥結束后大鼠禁食不禁水12 h后取材。稱重并記錄其體質量（BW），2%的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射后固定，胸腹部脫毛，75%酒精消毒皮膚，暴露腹腔，以一次性采血針腹主動脈取血8～10 mL，離心，吸取上層血清，分裝置于-80℃冰箱中保存備用。

1.6.3 心臟重構指標檢測 腹主動脈取血后，迅速開胸取出心臟，用預冷的生理鹽水沖洗干凈殘余血液，濾紙吸干水分后，用微型電子天平稱取心臟質量（HW）和左心室質量（LVM），心臟質量指數=HW/BW和左室質量指數（LVMI）=LVM/BW。

1.6.4 心肌組織病理觀察 取心尖部組織固定在10%甲醛溶液中，經石蠟包埋后制成厚度約4 μm的切片，進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察。

1.6.5 血清和心肌AngⅡ檢測 按上海信裕生物科技有限公司提供的試劑盒說明書檢測血清和心肌AngⅡ水平。

1.6.6 心肌Mn-SOD和MDA檢測 按試劑盒說明書測定心肌組織中Mn-SOD和MDA含量。

1.6.7 Western blotting檢測 每100 mg心肌組織置于培養皿中，手術剪剪碎成4 mm×4 mm左右的小塊，加入冷裂解液0.5～1 mL，玻璃勻漿器上下手動勻漿，勻漿液在4℃，以3 000 r/min離心5 min，取上清轉移測蛋白濃度；GAPDH作為內參，取待測蛋白樣品經SDSPAGE電泳，轉移至NC膜上，將NC膜放入平皿中，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，洗膜3次。放入含NOX4、NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2一抗的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜。吸棄一抗，用5%脫脂奶粉封閉液稀釋半抗兔HRP標記二抗，室溫搖床振蕩反應1～2 h。洗膜后顯影、定像。使用軟件對結果進行灰度分析。

1.7 統計學處理

應用SPSS24.0統計軟件。計量資料符合正態分布及方差齊性時以（±s）表示，多樣本均數比較采用One-Way ANOVA及SNK多重比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌HE染色結果

見圖1。WKY組心肌細胞體積正常，排列整齊，心肌各層均勻，結構清晰；SHR組心肌細胞腫脹變性，心肌纖維排列紊亂，心肌成纖維細胞增殖（見箭頭）；OBH組心肌細胞變性，心肌纖維排列紊亂成波浪狀（見箭頭），核固縮，成纖維細胞增殖明顯；中藥低劑量組心肌輕度水腫，心肌纖維排列紊亂，或見個別成纖維細胞浸潤；中藥高劑量組心肌輕度水腫，細胞核形態趨于正常的圓形或橢圓形，心肌纖維排列趨于整齊，或見個別成纖維細胞浸潤；纈沙坦組心肌細胞輕度變性，心肌纖維輕度波浪狀。

圖1 各組大鼠心肌細胞形態觀察（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠心臟重構指標比較

見表1。結果顯示OBH組心臟質量指數高于WKY組（P＜0.05），中藥高劑量組和纈沙坦組均可顯著降低大鼠心臟質量指數（P＜0.05）；OBH組LVMI高于SHR組和WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可顯著降低大鼠LVMI（P＜0.05），中藥低劑量組和中藥高劑量組比較差異無統計學意義。

表1 各組大鼠心臟重構指標比較（±s）

表1 各組大鼠心臟重構指標比較（±s）

注：與WKY組比較，*P＜0.05；與SHR組比較，#P＜0.05；與OBH組比較，◇P＜0.05；與中藥低劑量組比較，※P＜0.05；與中藥高劑量組比較，△P＜0.05。下同。

LVMI（mg/g）2.60±0.13 2.99±0.15*3.26±0.27*#2.91±0.08*◇2.71±0.12#◇2.46±0.13#◇※組別WKY組SHR組OBH組中藥低劑量組中藥高劑量組纈沙坦組n 6 6 6 6 6 6心臟質量指數（mg/g）3.23±0.21 3.72±0.22*3.69±0.22*3.49±0.12*#3.25±0.11#◇※3.09±0.13#◇※

2.3 各組大鼠心臟超聲指標比較

見表2。結果顯示OBH組LVM-cor高于WKY組（P＜0.05），中藥高劑量組和纈沙坦組均可降低LVM-cor（P＜0.05）；各組間LVIDd、IVSd、LVPWd比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠心臟超聲指標比較（±s）

表2 各組大鼠心臟超聲指標比較（±s）

組別WKY組SHR組OBH組中藥低劑量組中藥高劑量組纈沙坦組n 3 3 3 3 3 3 LVM-cor（mg）832.91±100.00 983.07±72.56 1 129.66±50.28*1 044.93±149.78*952.93±28.70◇923.73±101.16◇LVIDd（mm）7.01±1.01 7.38±0.84 7.40±0.78 6.86±0.83 7.18±0.64 7.19±0.23 IVSd（mm）2.12±0.25 2.17±0.18 2.59±0.22 2.54±0.45 2.20±0.28 2.13±0.21 LVPWd（mm）1.90±0.49 2.08±0.45 2.06±0.29 2.21±0.55 2.07±0.05 2.03±0.18

2.4 各組大鼠血清和心肌AngⅡ水平比較

見表3。結果顯示OBH組血清AngⅡ高于SHR組和WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可下降血清AngⅡ（P＜0.05），纈沙坦組優于中藥高劑量組，中藥高劑量組優于中藥低劑量組；OBH組心肌AngⅡ高于SHR組和WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可下降心肌AngⅡ（P＜0.05），但3個用藥組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠AngⅡ、MDA、Mn-SOD水平比較（±s）

表3 各組大鼠AngⅡ、MDA、Mn-SOD水平比較（±s）

組別WKY組SHR組OBH組中藥低劑量組中藥高劑量組纈沙坦組n 6 6 6 6 6 6血清AngⅡ（pg/mL）257.89±55.38 598.66±678.54*678.54±106.31*#565.00±122.87*◇445.61±75.32*#◇※352.73±62.14*#◇※△心肌AngⅡ（μg/g）34.57±14.59 82.34±17.57*104.82±27.73*#73.70±23.90*◇64.04±20.56*◇56.30±23.07*#◇心肌 MDA（nmol/mg）3.32±0.81 6.47±0.79*7.68±0.41*5.12±0.25*#◇4.85±0.58*#◇4.74±0.45*#◇心肌 Mn-SOD（U/mg）52.23±7.58 18.39±3.56*14.66±4.13*34.26±7.02*#◇38.57±6.65*#◇39.17±7.15*#◇

2.5 各組大鼠心肌氧化應激指標比較

見表3。結果顯示OBH組心肌MDA水平高于WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可降低MDA（P＜0.05），3個用藥組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；OBH組心肌Mn-SOD水平低于WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可升高心肌Mn-SOD（P＜0.05），3個用藥組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.6 各組大鼠心肌NOX4、NF-κB p65蛋白水平和ERK1/2磷酸化比值比較

見表4，圖2。結果顯示OBH組NOX4水平高于WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可降低NOX4水平（P＜0.05），3個用藥組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；OBH組NF-κB p65表達高于SHR組和WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可降低NF-κB p65水平（P＜0.05），3個用藥組組間比較差異無統計學意義；OBH組ERK1/2磷酸化比值高于SHR組和WKY組（P＜0.05），中藥低劑量組、中藥高劑量組和纈沙坦組均可降低心肌ERK1/2磷酸化比值（P＜0.05），3個用藥組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組心肌NOX4、NF-κB p65蛋白水平和ERK1/2磷酸化比值比較（±s）

表4 各組心肌NOX4、NF-κB p65蛋白水平和ERK1/2磷酸化比值比較（±s）

組別WKY組SHR組OBH組中藥低劑量組中藥高劑量組纈沙坦組n 6 6 6 6 6 6 NOX4 0.25±0.08 0.73±0.25*1.06±0.30*0.65±0.17*◇0.63±0.22*◇0.51±0.33◇NF-κB p65 0.23±0.03 0.68±0.16*0.98±0.17*#0.64±0.04*◇0.69±0.08*◇0.55±0.12*◇ERK1/2磷酸化比值0.92±0.14 1.71±0.39*2.42±0.63*#1.80±0.21*◇1.40±0.20◇1.35±0.56◇

圖2 各組大鼠心肌NOX4、NF-κB p65、ERK1/2蛋白表達水平

3 討 論

我國高血壓患病率高達29.6%，患者已達3億［4］。左室肥厚（LVH）是高血壓常見的靶器官損害，也是心臟病發病率和死亡率增加的獨立危險因素。高血壓和肥胖分別占LVH病因的25%和14%，二者合并存在則高達52%［6］，不容忽視。

中醫將OBH多歸于“眩暈”等范疇，屬本虛標實之證。OBH者多恣食肥甘厚味，肝氣易動，脾失健運，痰濁內蘊，阻塞脈道，血運失暢，瘀血漸生，痰瘀阻滯，損傷心脈，可致心肌重構。活血潛陽祛痰方是基于“陽亢、血瘀、痰濁”的組方，課題組既往發現，該方既能降壓，又可降低OBH大鼠的Lee's指數，為緩解LVH奠定了基礎［7］。OBH大鼠心肌細胞變性明顯，心肌纖維排列紊亂成波浪狀，核固縮，成纖維細胞增殖明顯，心臟質量指數、LVMI和LVM-cor均顯著升高（P＜0.05），具有明顯的LVH。中藥能顯著降低LVMI，中藥高劑量組心臟質量指數、LVM-cor值、血清和心肌AngⅡ水平顯著降低（P＜0.05），療效優于中藥低劑量組。

NOX4是心臟活性氧（ROS）的主要來源［8］，參與了壓力和容量負荷增加引起的心肌肥厚［9］和AngⅡ誘導的心肌肥大［10］。過表達NOX4或AngⅡ誘導心肌內源性NOX4增加，可誘導心臟纖維化和心肌細胞凋亡［11］。奧美沙坦酯可抑制NOX4基因表達和ROS的產生，發揮了改善心肌纖維化和心肌重構的作用，且該作用獨立于其降壓作用［12］。本研究發現OBH組心肌有明顯的氧化應激失衡，其Mn-SOD水平降低，而MDA和NOX4表達水平升高。活血潛陽祛痰方可降低MDA和NOX4表達（P＜0.05），提高Mn-SOD水平（P＜0.05）。可見調控氧化應激穩態可能是活血潛陽祛痰方改善心肌重構的機制之一。

過表達NOX4和/或外源性AngⅡ輸注均可激活心肌NF-κB信號通路［11］。NF-κB激活后可移位到核內，促進相關炎性因子的釋放，導致心肌成纖維細胞（CF）的增殖，參與心肌肥厚［13］。ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶家族中的一個重要亞族，可調節細胞增殖。活化的ERK1/2通過級聯反應激活NF-κB使其磷酸化，誘導炎癥反應，促進糖尿病和高血壓心肌中膠原沉積［14-15］。體外實驗發現，AngⅡ可激活CF中的ERK1/2和NF-κB［16］，參與了膠原積聚和纖維化。ERK1/2敲除可以逆轉主動脈結扎小鼠的高血壓性心肌肥厚［17］，抑制ERK1/2也能阻斷內皮素-1誘導的SHR心肌細胞的肥大［18］。因此，下調ERK1/2—NF-κB信號通路可能是改善心肌重構的靶點。活血潛陽祛痰方能下調OBH心肌中ERK1/2和NF-κB的激活來改善心肌肥厚，炎癥反應可能是OBH心肌重構的重要環節。

綜上可見，氧化應激和炎癥反應交互作用參與了OBH心肌重構，二者間作用錯綜復雜，具體機制有待進一步研究。活血潛陽祛痰方可改善OBH大鼠心肌肥厚，具有靶器官保護作用，調控氧化應激和炎癥反應是其可能作用機制。