十二井穴流注放血干預急性腦缺血模型大鼠HSP70及CD31表達的研究*

趙婷婷 郝利芳 張 蕊 趙立新

（山西省中醫院，山西 太原 030012）

急性腦缺血（ACI）是由于腦動脈血管閉塞導致的腦部血液循環障礙，造成腦組織缺血壞死并伴隨不同程度的神經功能缺失及其他后遺癥［1］，臨床病理表現為神經元、神經膠質細胞減少［2］，是具有高致殘和致死率的急性心腦血管疾病之一。ACI常見治療方法有藥物治療、手術治療外及干細胞替代治療等［3-4］。近年來中醫中藥對ACI的治療研究及效果受到廣泛關注，其中十二經脈氣血流注理論也應用于ACI的治療中［5-7］。本研究針對ACI在辰時時段高發的特點，結合不同時辰氣血運行至不同經絡的特點給予腦缺血模型大鼠十二井穴流注放血療法干預，比較十二井穴流注放血療法和普通十二井穴放血對ACI的治療效果，為中醫臨床治療ACI提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2～3月齡SD大鼠60只，雌雄各半，體質量（220.0±10.0）g，由山西省中醫藥研究院動物實驗中心提供。飼養條件為（23.0±1.5）℃恒溫、（60.0±5.0）%恒濕，12 h晝夜節律交替，適應性喂養1周后進行造模。本實驗通過山西省中醫藥研究院動物倫理委員會的審批，嚴格按照動物倫理委員會的各項要求執行。

1.2 試藥與儀器

1）試藥：免疫組化PV-9000檢測試劑盒、DAB顯色液購自北京中杉金橋生物公司；anti-CD31、anti-HSP70抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；丁苯酞軟膠囊（0.1g/粒）購自石藥集團恩必普藥業有限公司。2）儀器：針灸針（30號，1寸，漢醫牌）；2135型組織切片機（德國Leica）；Moticam 3000顯微攝影成像系統（美國Motic）；932型電熱燒灼器（上海醫療電子儀器廠）；Olympus光學顯微鏡（日本Olympus）。

1.3 造模及分組

實驗動物隨機分為假手術組、模型組、普通放血組、流注放血1組、流注放血2組、西藥組，每組10只，分籠飼養。除假手術組外，其余各組參照局灶性凝結大腦中動脈法［8］建立大鼠大腦中動脈梗阻（MCAO）模型，方法如下：腹腔注射200 μL 0.4%戊巴比妥鈉溶液麻醉后右側臥位固定大鼠，剃去耳后至頸部鼠毛后消毒處理，沿眼眶后至耳的連線中點縱向切口1～2 cm，暴露頜骨，輕抬頭部可見橫過嗅束上行的大腦中動脈（MCA）。用燒紅的電阻絲輕靠接觸嗅束上緣暴露的MCA，使之發生快速凝閉，若發生血管破裂出血應用小棉球局部輕壓止血，誘發MCAO模型。假手術組大鼠僅用玻璃分針游離出單側MCA，不做誘導處理。切口縫合并消毒，以術后出現同側霍納氏（Homer）綜合征、左側肢體疼痛回縮遲鈍或消失、對側偏癱、活動時出現左側傾倒及懸尾時出現左上肢向胸前屈曲等作為造模成功標準。

1.4 干預方法

1）普通放血組：選取位于大鼠四肢趾端的十二井穴，每側計6穴。用膠布處理毫針針尖，使其刺入皮膚深度限定在1 mm。用處理后的毫針每日7∶00依次按照少商、商陽、中沖、關沖、少沖、少澤、涌泉、隱白、大敦、厲兌、足竅陰、至陰穴的順序點刺放血，每穴放血量為1滴。2）流注放血1組：取穴、放血量均與普通放血組相同。依照十二經脈流注次序，從當值經脈的井穴開始，每日7∶00取大鼠四肢對應人十二井穴解剖位置［9］，依照厲兌、隱白、少沖、少澤、至陰、涌泉、中沖、關沖、足竅陰、大敦、少商、商陽順序，先左側后右側依次放血。3）流注放血2組：取穴、放血量均與普通放血組相同。依照十二經脈流注次序，在經脈流注和井穴交接時刻，選擇當值經脈的井穴放血，每日5∶00（寅時-卯時交接）先后放肺經和大腸經之少商、商陽穴；9∶00（辰時-已時交接）放胃經和脾經之厲兌、隱白穴；13∶00（午時-未時交接）放心經和小腸經之少沖、少澤穴；17：00（申時-酉時交接）放膀胱經和腎經之至陰、涌泉穴；21∶00（戌時-亥時交接）放心包和三焦經之中沖、關沖穴；1∶00（子時-丑時交接）放膽經和肝經之足竅陰、大敦穴。4）西藥組：造模后按80 mg/kg腹腔注射10 mg/mL的丁苯酞稀釋液，治療時間與普通放血組針刺放血時間相同。5）假手術組及模型組：分別給予等量生理鹽水腹腔注射，正常喂養。治療1周后各組進行神經功能學評分及相關指標檢測。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 神經功能學評分 依據改良的神經功能缺陷評分量表（mNSS）［10］對大鼠神經功能進行打分評定，通過對提尾、平衡木、握力、運動能力、感知能力及反射能力打分評估模型大鼠的治療及預后情況，最高分數18分，分數越高代表神經系統功能損害越嚴重。分別于治療前、治療1周后記錄各組大鼠的評分情況，每只大鼠重復測定3次。每只大鼠重復測定3次。

1.5.2 腦組織缺血區病理變化 各組大鼠于神經功能評分完成后給予10%水合氯醛腹腔深度麻醉，迅速開胸暴露心臟，心臟灌注處死。斷頭取腦，腦組織置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定過夜，組織浸蠟包埋，冷凍切片后用多聚耐氨酸固定于載玻片上，HE染色觀察大鼠腦組織病理形態學改變，觀察神經元是否皺縮及數量變化。

1.5.3 腦組織缺血區HSP70、CD31表達 免疫組化參照PV-9000試劑盒說明書，分別取腦組織切片，經枸櫞酸鈉抗原修復后采用兩步法染色檢測缺血區及周圍腦組織HSP70及CD3蛋白表達情況，每組大腦在高倍鏡視野下隨機選取3個缺血區視野，拍照并計數視野內陽性細胞數量，圖片采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統，取均值比較各組大鼠組織水平相關蛋白表達差異。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 造模后大鼠一般情況

除假手術組，其余5組大鼠造模后均出現不同程度的同側霍納氏（Homer）綜合征、左側肢體疼痛回縮遲鈍或消失、對側偏癱、行走時出現左側傾倒及懸尾時出現左上肢向胸前屈曲等行為異常表征，mNSS評分組間不存在明顯差異（表1），均符合本研究納入標準用于實驗治療。

2.2 各組大鼠mNSS評分結果比較

見表1。根據mNSS評分結果下顯示假手術組大鼠治療前后均無神經功能缺陷，模型組大鼠治療前后均表現為明顯神經功能缺陷，普通放血組、流注放血1組、流注放血2組和西藥組大鼠治療后mNSS評分均較治療前顯著降低（P＜0.05）；與普通放血組相比，流注放血2組、西藥組大鼠治療后mNSS評分顯著降低（P＜0.05），同時西藥組與流注放血2組大鼠治療后mNSS評分間無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠mNSS評分結果比較（分，±s）

表1 各組大鼠mNSS評分結果比較（分，±s）

注：與本組治療前比較，*P＜0.05；與普通放血組比較，△P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05。下同。

治療后0.50±0.01 13.33±1.67 10.26±1.01*▲9.66±0.88*▲8.35±0.69*△7.53±0.70*△組別假手術組模型組普通放血組流注放血1組流注放血2組西藥組n 10 10 10 10 10 10治療前1.00±0.02 13.14±1.41 12.86±1.26 13.19±1.19 13.05±0.94 13.21±1.54

2.3 各組大鼠腦組織病理變化

見圖1。結果顯示，假手術組大鼠腦組織結構完整，染色清晰，細胞正常，無明顯病理改變。模型組大鼠病理變化較為嚴重，顯微鏡下可見組織嚴重破損，神經元細胞大量丟失，膠質細胞增生并伴有大面積的血細胞聚集，局部存在炎性細胞浸潤。普通放血組大鼠病理切片較模型組相比組織結構略有恢復，其他方面改變差異并不明顯。流注放血1組大鼠腦組織破損已大部分恢復，細胞仍大量腫脹。流注放血2組大鼠腦組織結構基本恢復，神經元多數處于完整正常狀態，但局部仍可見損傷區域周邊存在較多細胞膨大、胞核皺縮等現象。西藥組大鼠腦組織結構基本恢復正常，細胞形態及數量顯著恢復，膠質細胞略有增生，少量細胞存在凋亡現象。

圖1 各組大鼠腦組織病理變化（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠腦組織HSP70、CD31蛋白表達比較

見表2，圖2～圖3。免疫組化染色后HSP70及CD31陽性反應細胞呈棕黃色深染，各組大鼠腦組織切片中陽性細胞表達量計數結果見表2。與模型組大鼠相比，普通放血組大鼠腦組織中HSP70、CD31蛋白表達量稍有增加但無顯著差異（P＞0.05），流注放血1組、流注放血2組及西藥組大鼠腦組織中HSP70、CD31蛋白表達量顯著增加（P＜0.05）；普通放血組大鼠腦組織HSP70、CD31蛋白表達量與流注放血1組無明顯差異（P＞0.05），而顯著低于流注放血2組和西藥組（P＜0.05）；西藥組大鼠腦組織中HSP70、CD31蛋白陽性表達數最多，但與流注放血2組大鼠無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠腦組織HSP70、CD31陽性表達數量比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織HSP70、CD31陽性表達數量比較（±s）

組別假手術組模型組普通放血組流注放血1組流注放血2組西藥組n 10 10 10 10 10 10 HSP70+20.56±5.15▲15.11±4.96▲19.67±6.86▲24.44±5.79*▲28.89±6.85*△33.78±6.78*△CD31+2.33±1.00▲3.33±1.12▲4.00±0.71▲5.56±1.42*▲7.89±0.78*△8.44±1.24*△

圖2 各組大鼠腦組織HSP70蛋白表達（IHC染色，400倍）

圖3 各組大鼠腦組織CD31蛋白表達（IHC染色，400倍）

3 討 論

《靈樞經》《類經》等著作中描述井穴為十二經脈陰陽之氣的始發之處［11］，十二經脈的“根”即為各經散布在手足四肢末端的井穴，因此井穴具有清熱安神、蘇厥鎮痛、醒腦開竅等作用，特別對于外感所致的高熱久稽、溫熱邪氣引發的高熱驚厥以及氣血不通所致的軀體痛癥的治療研究較為深入［12］，這其中針灸井穴起效快、療效顯著受到廣泛重視。氣血在十二經脈內的流注次序從手太陰肺經開始，依次流至手陽明大腸經、足陽明胃經、足太陰脾經、手少陰心經、手太陽小腸經、足太陽膀胱經、足少陰腎經、手厥陰心包經、手少陽三焦經、足少陽膽經、足厥陰肝經，再流至手太陰肺經，形成一個“陰陽相貫，如環無端”的整體循行系統［13］。在十二經脈氣血流注理論中，手足陰陽表里經的井穴在四肢末端井井相會能實現陰陽交錯，產生經氣，經氣不斷的積聚、充實進而促進經脈氣血沿著十二經脈氣血循環灌注［14］。

天之陰陽隨時間而遞相變化，“天人合一，天人相應”，人體陰陽亦隨之改變，故可從一日十二時辰所屬地支闡述人體陰陽盛衰的節律變化。子午流注學說以一天十二時辰流注十二經，即寅時從肺經開始依次流注大腸經、胃經、脾經、心經、小腸經、膀胱經、腎經、心包經、三焦經、膽經而終止于丑時肝經，遵循氣血晝夜流注規律而擇時施治即為子午流注納子法，又稱“納支法”［15］。井穴針灸基于這一理論遵循十二經脈氣血流注的各時辰和井穴循序逐漸發展和完善了起來，針對不同疾病的時間醫學規律和日夜節律變化給予了新的治療思路和方法。

本研究選取大鼠雙側十二經井穴進行針刺放血治療，分別設立普通放血組、流注放血1組、流注放血2組，流注放血1組按十二經脈流注次序在單一時段對十二經井穴放血治療，流注放血2組依照子午流注時間理論對十二經井穴放血治療：每日寅時-卯時交接時刻先后放肺經、大腸經之少商、商陽；辰時-已時交接時刻放胃經、脾經之厲兌、隱白；午時-未時交接時刻放心經、小腸經之少沖、少澤；申時-酉時交接時刻放膀胱經、腎經之至陰、涌泉；戌時-亥時交接時刻放心包、三焦經之中沖、關沖；子時-丑時交接時刻放膽經、肝經之足竅陰、大敦。比較普通放血法、按經脈流注次序單一時段放血以及子午流注放血對MCAO模型大鼠的治療效果。結果顯示，相較于治療前，普通放血組、流注放血1組、流注放血2組和西藥組治療方法均對模型大鼠神經功能具有顯著改善效果。比較各組治療后大鼠mNSS評分可見除注射治療丁苯酞軟膠囊陽性藥治療神經缺陷效果最佳外，3組針灸放血方法中流注放血2組治療效果與西藥組無異，普通放血組和流注放血1組治療效果較差。說明依照十二經脈流注次序，在經脈流注和井穴交接時刻，選擇當值經脈針灸放血的治療方法優于普通放血法和單一時段流注放血方法，其對神經功能缺陷的治療效果及腦組織損傷區域病理狀態的逆行改善效果顯著提高。在分子水平，HSP70是熱休克蛋白（HSPs）家族的主要成員之一，HSPs受到熱休克因子（HSF）誘導相關靶基因上熱休克原件（HSE）的表達而激活，因此在正常腦組織中HSP70為顯著低表達［16］，在缺氧、缺血及其他應急刺激下HSP70表達量會發生顯著變化。本研究模型組大鼠腦組織HSP70表達量最少，各治療組大鼠HSP70的表達量隨其治療效果改善而增加，同時免疫組化結果顯示HSP70的應激性表達分布主要集中于壞死神經元、局部梗死區域及炎性細胞浸潤區域周圍。以往研究表明，HSP70能夠發揮對神經元細胞的保護作用并改善腦內損傷部位炎性環境［17］，提示針灸井穴流注放血方法能夠通過激活HSP70的表達分泌，發揮對ACI模型大鼠的治療作用，推測其作用機制可能與炎癥抑制、削弱興奮性氨基酸對神經元的損傷，清除腦內過氧化物積聚、保護神經細胞有關。另一方面，CD31作為血管內皮特異性標志物［18］，CD31的表達增加表明針灸井穴流注放血能夠促進腦血管內皮新生，內皮細胞表達標志物增加改善缺血區腦組織病理結構變化，減少了血細胞在組織內的進一步積聚，與HE染色觀測結果一致。同樣說明了十二井穴流注放血的治療方法優于普通針灸放血，能加速腦組織損傷部位血管新生，改善腦血流的循環代謝。

前期研究多集中于腦缺血后即刻給予十二井穴放血對細胞內c-fos蛋白表達調節、腦血管流速雙向調節及各井穴電生理等方面的顯著調節作用［19-20］。治療方法也局限于單一治療時段及針刺順序，未對針灸井穴和時間與經脈血流循環順序的相關性加以重視和探究。本研究首次探究了十二井穴流注放血對ACI大鼠腦組織的保護作用及對神經缺陷的調節作用，且其治療效果優于普通辨證取穴及十二井穴放血法。《針灸大成》［21］記載“剛柔相配，陰陽結合，氣血循環，時穴開闔”，表明子午流注取穴施治方法能夠調和人體陰陽經脈銜接、疏通經絡從而改善氣血溝通循環，促進機體功能的恢復。本研究采用的十二井穴流注放血遵循了體內血液流經十二經脈支端隨時辰變化的客觀規律，擇時取穴，符合子午流注“天人合一”“臟氣法時”的理論基礎［22］。根據體內氣血虛衰的周期性變化規律配合氣血灌注順序定時、定序施針放血的治療方法，有效地激發機體的內在調節功能，并對腦缺血損傷所致血管梗阻、血管阻塞等具有治療效果，并進一步發現作用機制可能與激活HSP70表達保護神經元，促進腦損傷部位血管新生有關。此外本研究仍需深入探究十二井穴流注放血對腦內多通路、多機制的調節是否起作用，為臨床施治提供充分的理論依據。