殺撲磷降解產(chǎn)物的鑒定及在蔬菜中殘留量的檢測

朱正偉 陳 鋰 吳婉琴 江 豐 范小龍 王會霞

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430070；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術研究中心，湖北 武漢 430070)

中國是蔬菜生產(chǎn)大國，同時也是蔬菜消費大國。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫[1]顯示，2018年中國蔬菜產(chǎn)量已超過7.03億t。蔬菜在種植過程中會不同程度地使用殺蟲劑、除草劑、殺菌劑等農(nóng)藥，2018年中國農(nóng)藥使用量為150.36萬t[2]。

殺撲磷是一種硫代磷酸酯類有機磷農(nóng)藥，對介殼蟲的防治具有特效[8]，被廣泛應用于果樹、棉花、蔬菜等作物的失尖蚧、糠片蚧、蠟蚧、粉蚧等害蟲、害螨的防治[8]。殺撲磷屬于高毒性農(nóng)藥，對人類、鳥類、魚類等[9-10]多種生物均具有毒害作用。目前關于殺撲磷的研究主要集中于其檢測[11-12]和毒性[13-14]分析，對其降解物的研究暫未見報道。文章擬分析鑒定殺撲磷的降解產(chǎn)物，建立蔬菜中殺撲磷及其降解物殘留量的檢測方法，為殺撲磷及其降解物的食品安全風險監(jiān)測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

乙腈、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉、無水硫酸鎂：分析純，上海國藥化學試劑有限公司；

韭菜、包菜、西紅柿、芹菜：市售；

殺撲磷農(nóng)藥：市售；

殺撲磷標準品：純度≥99.9%，美國Supelco公司；

牛津郡殺撲磷標準品：純度≥98.5%，日本W(wǎng)AKO公司；

乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)：40～60 μm，北京艾杰爾科技有限公司；

石墨化炭黑(GCB)：40～120 μm，北京艾杰爾科技有限公司；

陶瓷均質(zhì)子：2 cm(長)×1 cm(外徑)，上海安譜實驗科技股份有限公司；

有機相微孔濾膜：0.22 μm，天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：TSQ型，美國沃特斯公司；

高效液相色譜—四極桿—飛行時間高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀：Triple TOF 5600+型，美國AB Sciex公司；

分析天平：MSA125P-1CE-DU型，德國Sartorius公司；

分析天平：ME204/02型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

離心機：Allegra X-15R型，美國Beckman公司；

均質(zhì)器：T25 digital型，德國IKA公司；

渦旋混合器：945605型，美國TALBOYS公司；

超純水儀：Milli-Q型，美國Millipore公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標準儲備溶液 準確稱取10 mg(精確至0.1 mg)各農(nóng)藥標準品，用色譜純乙腈溶解并定容，配成濃度為1 000 mg/L 的標準儲備溶液，-18 ℃避光保存。

1.3.2 標準中間溶液 準確吸取一定量的農(nóng)藥標準儲備溶液于容量瓶中，用乙腈定容配制成濃度為200 mg/L的標準中間液。

1.3.3 混合標準系列工作液 分別吸取一定量的農(nóng)藥標準中間溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成混合標準使用溶液，其中殺撲磷質(zhì)量濃度分別為1，5，10，20，40，60，100 ng/mL，牛津郡殺撲磷質(zhì)量濃度分別為1，3，6，15，30，60，100 ng/mL。

1.3.4 基質(zhì)混合標準工作溶液 取1 mL空白基質(zhì)溶液氮氣吹干，加入1 mL相應質(zhì)量濃度的混合標準系列工作液復溶，過微孔濾膜。基質(zhì)混合標準工作溶液應現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 試驗方法

1.4.1 自然光下水中殺撲磷降解產(chǎn)物研究 準確移取50 μL 殺撲磷中間液于玻璃比色管中，用超純水定容至20 mL，搖勻后置于自然光下，每天移取0.60 mL直接進行UPLC-Q-TOF-MS分析，數(shù)據(jù)用Peakview軟件分析，降解產(chǎn)物的毒性通過美國環(huán)境保護署的毒性估算軟件工具Toxicity Estimation Software Tool(T.E.S.T.)進行計算。

1.4.2 殺撲磷農(nóng)藥成分分析 按GB 20682—2006執(zhí)行。

1.4.3 蔬菜中殺撲磷及其降解產(chǎn)物殘留量檢測方法的建立

(1) 試樣制備：韭菜、西紅柿、甘藍、芹菜取可食用部分，切碎后放入組織搗碎機中打成勻漿，于聚乙烯瓶中冷凍貯藏。

(2) 基質(zhì)含量對殺撲磷及其降解物殘留量的影響：稱取10 g(精確至0.01 g)蔬菜樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，1顆陶瓷均質(zhì)子，渦旋提取1 min，加入7 g 氯化鈉，4 000 r/min離心5 min，取上清液分別用乙腈稀釋0，2，5，10，20，50倍，以此稀釋液為溶劑，配制質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的殺撲磷和牛津郡殺撲磷溶液，進行UPLC-MS/MS分析。

(3) 石墨化炭黑(GCB)對殺撲磷和牛津郡殺撲磷的吸附：準確移取100 μL標準中間液于50 mL容量瓶，用乙腈定容后搖勻，移取2 mL于15 mL離心管中，并分別加入0，10，20，30，40，50，60，80，100，150 mg GCB，渦旋30 s，4 000 r/min離心3 min，取上清液進行UPLC-MS/MS分析。

(4) 3種QuEChERS方法比較：EN-QuEChERS農(nóng)殘方法參照EN 15662、AOAC-QuEChERS農(nóng)殘方法參照AOAC Official Method 2007.01，原始QuEChERS方法的前處理為：稱取10 g樣品于50 mL離心管，加入10 mL乙腈、4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉，劇烈振蕩1 min，4 000 r/min 離心3 min，從乙腈層移取6 mL置于15 mL離心管中，加入900 mg無水硫酸鎂和150 mg PSA渦旋1 min，4 000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜后進行UPLC-MS/MS分析。

(5) 線性范圍測定：按1.3.3的方法分別配制4種基質(zhì)(韭菜、西紅柿、甘藍、包菜)標準工作液，進行UPLC-MS/MS分析。

(6) 定量限測定：在韭菜、西紅柿、甘藍、包菜中添加適量的標準溶液，按已優(yōu)化好的方法進行處理，上UPLC-MS/MS分析，計算殺撲磷和牛津郡殺撲磷的信噪比(S/N)，以S/N為10時的加標水平為定量限。

(7) 基質(zhì)效應：根據(jù)殺撲磷和牛津郡殺撲磷在韭菜、西紅柿、甘藍、芹菜基質(zhì)標準曲線中的斜率，按式(1)計算基質(zhì)效應。

ME=(km/ks-1)×100%，

(1)

式中：

ME——基質(zhì)效應，%；

km、ks——基質(zhì)標準曲線和溶劑標準曲線的斜率。

當-20%

(8) 準確度測定：依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告2386號《農(nóng)藥殘留檢測方法國家標準編制指南》，選取殺撲磷質(zhì)量濃度分別為0.005，0.015，0.050 mg/kg，牛津郡殺撲磷質(zhì)量濃度分別為0.003，0.010，0.050 mg/kg的加標水平，按已優(yōu)化的前處理方法進行加標回收試驗，每個加標水平重復6次。

(9) 精密度測定：根據(jù)殺撲磷和牛津郡殺撲磷準確度試驗中的6次重復性結(jié)果，計算不同加標水平的RSD。

1.4.4 儀器條件

(1) UPLC-Q-TOF-MS條件:液相色譜條件：C18色譜柱，50 mm×2.1 mm×1.7 μm，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸—水溶液，其梯度洗脫程序見表1。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源(ESI)，正離子掃描，采集范圍m/z50～1 000，離子源溫度550 ℃。

(2) UPLC-MS/MS條件:液相色譜條件：C18色譜柱，50 mm×2.1 mm×1.7 μm，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸—水溶液，其梯度洗脫程序見表2。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源(ESI)，正離子掃描，多反應監(jiān)測，離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度450 ℃，毛細管電壓2 500 V，其定性離子對、定量離子對及錐孔電壓和碰撞能量見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然光下水中殺撲磷降解產(chǎn)物的鑒定

表1 梯度洗脫程序

表2 梯度洗脫程序

表3 殺撲磷和牛津郡殺撲磷的質(zhì)譜參數(shù)

利用T.E.S.T.軟件計算殺撲磷和牛津郡殺撲磷的毒性，其結(jié)果見表4。由表4可知，大鼠經(jīng)口LD50、生物富集因子的計算值與試驗值比較接近，說明利用T.E.S.T.軟件計算的結(jié)果具有一定的參考性。牛郡津殺撲磷的LD50高于殺撲磷，但按中國農(nóng)藥的毒性分類，其仍屬于高毒農(nóng)藥，具有遺傳毒性。

2.2 殺撲磷農(nóng)藥成分分析

經(jīng)上機分析發(fā)現(xiàn)，購買的殺撲磷農(nóng)藥中，殺撲磷和牛津郡殺撲磷含量分別為71.0，1.5 g/kg，說明殺撲磷農(nóng)藥在生產(chǎn)階段或貯藏過程中易降解為牛津郡殺撲磷，將其噴灑于植物后，會在植物中殘留。

2.3 蔬菜中殺撲磷及其降解產(chǎn)物殘留量檢測方法的建立

2.3.1 基質(zhì)含量對殺撲磷及其降解產(chǎn)物殘留量的影響

由圖2、圖3可知，不論是顏色深的韭菜還是顏色淺的甘藍，隨著稀釋倍數(shù)的增加，基質(zhì)含量降低，殺撲磷和牛郡津殺撲磷的響應與同濃度的溶劑標準溶液的響應越接近，說明基質(zhì)含量對殺撲磷和牛津郡殺撲磷的響應影響較大，有必要對樣品進行凈化處理，減小基質(zhì)帶來的抑制影響。

圖1 殺撲磷及其降解產(chǎn)物的提取色譜圖Figure 1 Extract chromatogram of methidathion and methidathion-oxon

表4 T.E.S.T.軟件計算的殺撲磷和牛郡津殺撲磷的毒性數(shù)據(jù)

2.3.2 GCB對殺撲磷和牛津郡殺撲磷的吸附影響 GCB可以很好地除去蔬菜中的色素，減弱基質(zhì)效應，減輕對儀器的污染，但除去色素的同時，也會對一些平面結(jié)構的農(nóng)藥具有強的吸附性。由圖4、圖5可知，隨著GCB加入量的增多，殺撲磷和牛郡津殺撲磷的回收率均下降，但殺撲磷對GCB表現(xiàn)得更敏感；當GCB加入量相同時，牛郡津殺撲磷的回收率明顯高于殺撲磷，故選擇兩者回收率均>80%時為GCB的較優(yōu)加入量，即加入量為25 mg/mL。

2.3.3 3種QuEChERS前處理方法比較 由圖6、圖7可知，3種前處理方法對牛津郡殺撲磷回收率無顯著差異；EN-QuEChERS前處理方法對殺撲磷的回收率優(yōu)于其他兩種方法，故選擇改良后的EN-QuEChERS方法為較優(yōu)方法。

2.3.4 線性范圍 上機測定發(fā)現(xiàn)，當樣品質(zhì)量濃度為1～100 ng/mL 時，韭菜、西紅柿、甘藍、芹菜的基質(zhì)匹配標準曲線線性良好(R2≥0.99)。

2.3.5 定量限 試驗發(fā)現(xiàn)，殺撲磷和牛津郡殺撲磷的最優(yōu)定量限分別為0.005，0.003 mg/kg，其在4種基質(zhì)中的信噪比見表5。

2.3.6 基質(zhì)效應 由圖8可知，殺撲磷在西紅柿基質(zhì)中呈中等強度的基質(zhì)效應(20%<|ME|<50%)，在其他基質(zhì)中呈強的基質(zhì)效應(|ME|≥50%)；牛津郡殺撲磷在西紅柿中呈弱的基質(zhì)效應(|ME|≤20%)，在包菜和芹菜中呈中等強度的基質(zhì)效應(20%<|ME|<50%)，而在顏色最深的韭菜中呈強的基質(zhì)效應(|ME|≥50%)。凈化后，凈化液基本呈無色，但基質(zhì)效應仍很強，所以在殺撲磷及其降解產(chǎn)物牛津郡殺撲磷的檢測過程中仍需用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量。

Ks表示溶劑標準溶液，K0、K2、K5、K10、K20、K50分別表示稀釋0，2，5，10，20，50倍的基質(zhì)標準溶液圖2 基質(zhì)含量對殺撲磷響應的影響Figure 2 Effect of different matrix concentrations on the response of methidathion

Ks表示溶劑標準溶液，K0、K2、K5、K10、K20、K50分別表示稀釋0，2，5，10，20，50倍的基質(zhì)標準溶液圖3 基質(zhì)含量對牛津郡殺撲磷響應的影響Figure 3 Effect of different matrix concentrations on the response of methidathion-oxon

圖4 GCB加入量對殺撲磷回收率的影響Figure 4 Effect of different GCB content on the recovery of methidathion

圖5 GCB加入量對牛津郡殺撲磷回收率的影響Figure 5 Effect of different GCB content on the recovery of methidathion-oxon

圖6 3種QuEChERS前處理方法對殺撲磷回收率的影響Figure 6 Effect of three QuEChERS pretreatmentmethods on recovery of methidathion

圖7 3種QuEChERS前處理方法對牛津郡殺撲磷回收率的影響Figure 7 Effect of three QuEChERS pretreatment methods on recovery of methidathion-oxon

表5 殺撲磷和牛津郡殺撲磷在4種基質(zhì)中的信噪比

2.3.7 準確度 由圖9、圖10可知，低、中、高加標水平下，殺撲磷和牛津郡殺撲磷在4種基質(zhì)中的回收率分別為68.5%～97.2%，62.9%～94.3%，均能滿足《農(nóng)藥殘留檢測方法國家標準編制指南》的要求。

2.3.8 精密度 由表6可知，殺撲磷和牛郡津殺撲磷的RSD均在《農(nóng)藥殘留檢測方法國家標準編制指南》規(guī)定的范圍之內(nèi)。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化前處理方法，建立了蔬菜中殺撲磷及其降解產(chǎn)物殘留量的檢測方法，該方法的線性范圍、定量限、基質(zhì)效應、準確性和精密度等指標均能滿足《農(nóng)藥殘留檢測方法國家標準編制指南》的要求，適用于植物源中殺撲磷及牛津郡殺撲磷殘留量的測定。自然條件下，殺撲磷易降解為牛津郡殺撲磷，但牛津郡殺撲磷的穩(wěn)定性如何，會繼續(xù)降解成何種物質(zhì)，有待進一步研究。

圖8 殺撲磷和牛津郡殺撲磷在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應Figure 8 Matrix effect diagram of methidathion and methidathion-oxon in different matrices

圖9 不同加標水平下殺撲磷的回收率Figure 9 Matrix effect diagram of methidathion in different matrices

圖10 不同加標水平下牛津郡殺撲磷的回收率Figure 10 Matrix effect diagram of methidathion-oxon in different matrices

表6 不同加標水平下殺撲磷和牛郡津殺撲磷在4種基質(zhì)中的精密度