堿提西番蓮葉多糖的分離、鑒定及生物活性

李 霞 劉承鑫 黃 艷 莫觀蘭 關 媛

(桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西 桂林 541006)

西番蓮(PassifloraedulisSims)含有大量對人體有益的活性物質及礦物元素[1]，其葉被視為一種藥材，用于醫治失眠、情緒失常和癲癇，有緩解止痛的功效[2]。現有研究表明植物多糖具有降血糖和抗凝活性，Colomeu等[3]研究表明西番蓮葉水提物中酚類化合物具有一定糖尿病免疫作用；全娜[4]研究發現枸杞葉多糖顯著提高小鼠血清胰島素的含量，降低血糖的同時也能保護糖尿病小鼠臟器及血清內酶活力；馬琳[5]研究得出堿提紅棗多糖對APTT值的延長達到水提紅棗多糖的11.1倍，說明堿提紅棗多糖抗凝效果較好；Francisco等[6]研究表明紅藻中的硫酸化多糖不僅具有良好的抗凝血作用，還具備有效的抗血栓形成作用以及抑制血小板聚集的作用。

目前，關于西番蓮果皮抗氧化[7-8]、降血壓[9]等方面的研究文獻較多，但對西番蓮葉中多糖組分的體外降血糖和抗凝血活性研究還沒有詳細的報道。植物多糖除水溶性多糖外，還有大量的胞內多糖或細胞壁結合多糖，熱水提取法不能使之溶出，且水提后的殘渣通常會被丟棄，而一定濃度堿溶液可以繼續提出殘渣中的細胞壁結合多糖或胞內多糖[10]。研究擬以熱水提取后的西番蓮葉殘渣為原料，利用堿溶液從殘渣中繼續提取多糖，對多糖進行測定，并進行體外降血糖和抗凝血活性的研究，以期為西番蓮葉中多糖相關藥物的研究開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

西番蓮葉：桂林萬禾農產品有限公司；

NaOH、葡萄糖標準品、無水乙醇、3，5-二硝基水楊酸、無水碳酸鈉等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

苯酚：分析純，天津市永大化學試劑有限公司；

考馬斯亮藍：分析純，合肥博美生物科技有限責任公司；

α-淀粉酶：3.7 U/mg，北京索萊寶科技有限公司；

α-葡萄糖苷酶：酶活25 U/mg，上海源葉生物科技有限公司；

阿卡波糖：杭州中美華東制藥有限公司；

肝素鈉：北京索萊寶科技有限公司；

活化部分凝血活酶時間測定試劑盒、凝血酶原時間測定試劑盒、凝血酶時間測定試劑盒：上海太陽生物技術有限公司。

1.2 主要儀器與設備

旋轉蒸發儀：UV760CRT型，上海賢德實驗儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV760CRT型，上海傲譜分析儀器有限公司；

冷凍干燥儀：ALPHA1-2LD型，德國Martin Christ公司；

離心機：DL-5-B型，上海安亭科學儀器有限公司；

振蕩培養箱：LRH-250-Z型，韶關市泰宏醫療器械有限公司；

傅里葉紅外光譜儀：IS10型，美國Thermo Fisher公司；

液相色譜儀：LC1220型，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取與分離 西番蓮葉烘干粉碎，用75%的乙醇在85 ℃下冷凝回流提取2 h，提取3次。將醇提后的西番蓮葉烘干，按照料液比(m西番蓮葉∶V乙醇)1∶16 (g/mL)、100 ℃ 熱水提取6 h，將熱水提取后的西番蓮葉殘渣烘干，以料液比(m西番蓮葉殘渣∶VNaOH)1∶15.6 (g/mL)用6% NaOH浸泡12 h后，60 ℃水浴提取1 h，提取4次，得到西番蓮葉的堿提液，濃縮至其1/6體積，冷卻，加入3倍體積無水乙醇，4 ℃醇沉48 h，過濾，4 500 r/min離心15 min，蒸餾水復溶，35%鹽酸中和，流水透析48 h，冷凍干燥[11]，得到堿提西番蓮葉粗多糖(APEL)。將APEL用DEAE-52纖維素柱分離，分別用蒸餾水洗脫出APEL-3、0.7 mol/L NaCl洗脫出APEL-2、0.1 mol/L NaOH溶液洗脫出APEL-1，流速15 mL/min。

1.3.2 多糖主要成分測定

(1) 總糖含量：采用苯酚—硫酸法[12]。

(2) 糖醛酸含量：間羥基聯苯法[13]。

(3) 蛋白質含量：考馬斯亮藍法[14]。

(4) 還原糖含量：3,5-二硝基水楊酸法[15]。

1.3.3 紅外光譜分析 取適量多糖樣品，按照(m多糖∶m溴化鉀)1∶100的比例加入干燥的溴化鉀晶體，均勻研磨后壓片，于4 000～400 cm-1區間用傅里葉紅外光譜進行掃描分析。

1.3.4 單糖組成分析 采用高效液相色譜法[16]。將含1 mol/L HCl的無水甲醇(0.5 mL)和多糖樣品(2 mg)混合并在80 ℃下水解16 h，然后在120 ℃下用2 mol/L 三氟乙酸(0.5 mL)水解1 h。用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)處理所得的水解產物，并在連接Shimadzu的DIKMA Inertsil ODS-3色譜柱(4.6 mm×150 mm)上進行分析。選用SPD-10AVD UV-VIS檢測器。注入PMP衍生物(20 μL)，用82.0% 磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)和18.0%乙腈(VPBS∶V乙腈)4.5∶1.0的比例以1.0 mL/min 的流速洗脫，并通過245 nm下的紫外光譜(UV)進行監測。

1.3.5 相對分子質量測定 采用凝膠滲透色譜法[17]。色譜條件：配備RI檢測器的Tosoh EcoSEC HLC-8320凝膠色譜柱和TSKgel guard PW×l + 2×TSKgel MPW×l + TSKgel G2500PW×l (7.8 mm×300 mm)色譜柱，流動相為0.1 mol/L NaNO3，流速1 mL/min，上樣體積100 μL，柱溫40 ℃。

1.3.6 體外降血糖活性測定

(1) 對α-淀粉酶的抑制作用：根據文獻[18]修改如下，取1 mL不同濃度梯度的樣品溶液，加入0.3 mL酶液，并在37 ℃預熱20 min，加入0.4 mL淀粉溶液混勻反應5 min，加入1 mL鹽酸，0.2 mL碘液搖勻，于660 nm處測量吸光度值A1，用蒸餾水代替酶液測量吸光度值A2，蒸餾水作為空白，吸光度值為A0，以阿卡波糖為陽性對照，按式(1)計算α-淀粉酶清除率。

(1)

式中：

K——α-淀粉酶清除率，%；

A0——蒸餾水代替樣品反應后的吸光值；

A1——加入樣品反應后的吸光度值；

A2——蒸餾水代替酶液反應后的吸光度值。

(2) 對α-葡萄糖苷酶的抑制作用：取112 μL 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液與0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液20 μL混合后加入二甲基亞砜8 μL，然后加入不同濃度梯度的樣品溶液50 μL，37 ℃下孵育20 min后加入10 mmol/L 的4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷20 μL，繼續孵育20 min，加入0.2 mol/L Na2CO380 μL，在410 nm下測定吸光度值A，并用不加樣品(不加樣品的以0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液代替)測定酶的活力吸光度值A0，以阿卡波糖為陽性對照[19]。按式(2)計算α-葡萄糖苷酶清除率。

(2)

式中：

S——α-葡萄糖苷酶清除率，%；

A0——不加樣品測定酶的活力吸光度值；

A——加入樣品反應后的吸光度值。

1.3.7 體外抗凝血活性測定 采集新鮮雞血，將0.109 mol/L 檸檬酸鈉溶液與全血按V檸檬酸鈉∶V全血=1∶9混合，3 600 r/min離心15 min，取上層血漿。以9%生理鹽水為溶劑配制0.10 g/L多糖樣品溶液，用9%生理鹽水將樣品溶液稀釋成5，20，50，100 μg/mL的質量濃度梯度。陽性對照：用9%生理鹽水配制質量濃度為0.10 g/L 的肝素鈉溶液[20]。采用上海太陽生物技術有限公司的試劑盒分別檢測活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)3個抗凝血活性指標。

1.3.8 數據分析 采用Origin 7.0作圖和SPSS 17.0軟件進行數據統計分析，并采用單因素方差分析(ANOVA)進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 多糖成分

如表1所示，APEL、APEL-1、APEL-2和APEL-3總糖質量分數分別為73.80%，81.42%，83.34%，62.93%，糖醛酸質量分數分別為9.38%，4.04%，9.15%，5.59%。APEL經過分離后，APEL-1、APEL-2和APEL-3的蛋白質和還原糖質量分數降低，說明使用DEAE-52纖維素柱分離APEL具有一定的純化效果，而其中蛋白質質量分數偏高，推測是在堿性條件下蛋白質易溶于溶液中，形成較難去除的高水平蛋白質[21]。

2.2 紅外光譜分析

如圖1所示，APEL及其各組分均在3 417 cm-1左右有較強的吸收峰，該峰是由多糖中的羥基O—H伸縮振動引起的[22]；在2 927～2 937 cm-1的吸收峰是C—H的伸縮振動，為糖類的特征峰；在1 635～1 639 cm-1附近處的吸收峰是由于C═O伸縮振動引起的[23]，表明含有糖醛酸；在1 400 cm-1附近的吸收峰是由于C—H的變角振動引起的；1 043～1 079 cm-1附近的吸收峰是由C—O的伸縮振動引起的[24]，其中APEL-3的C—O伸縮振動為變角振動。

表1 多糖樣品中化學成分和功能性成分質量分數比較

圖1 多糖樣品的紅外光譜圖Figure 1 Infrared spectra of polysaccharide samples

2.3 單糖組成成分

如表2所示，APEL由阿拉伯糖、半乳糖醛酸和半乳糖3種單糖組成，以阿拉伯糖為主，其相對質量分數為52.11%。與APEL相比，分離后得到的APEL-1、APEL-2 和APEL-3的單糖組成明顯發生變化；APEL-1主要由葡萄糖和木糖組成，其中葡萄糖組分相對質量分數最大為40.53%，木糖相對質量分數達32.36%；APEL-3 主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，同時含有少量的木糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸；APEL-2的單糖成分主要為半乳糖醛酸，其相對質量分數為58.63%，其次是阿拉伯糖(18.89%)和半乳糖(12.36%)；在所有的多糖中都能夠檢測到阿拉伯糖和半乳糖的存在，但其質量分數不同，并且這兩種單糖在所有的多糖中占比都比較大。中性多糖APEL-3中阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖質量分數相差不大，在糖鏈中分布較均勻；而酸性多糖APEL-2的糖鏈中半乳糖醛酸質量分數相對較高，所以阿拉伯糖和半乳糖質量分數較低。堿提多糖APEL-1中阿拉伯糖和半乳糖含量較低，葡萄糖和木糖質量分數較高，可能是在堿溶液洗脫過程中，各成分之間發生了相互轉化或部分產生了降解。

2.4 多糖相對分子質量

堿提西番蓮葉多糖及其組分的相對分子質量分布圖如圖2所示，APEL、APEL-1的相對分子質量分布圖中都是單峰，而APEL-2、APEL-3的有多個峰，說明APEL-2和APEL-3中可能存在其他雜質，純度不高，需要進一步分離純化。從相對分子質量大小來看，堿提多糖APEL及其組分相對分子質量都比較大，且分布較集中。多糖樣品中各峰對應的相對分子質量見表3。

表2 各樣品單糖組分的相對質量分數

圖2 多糖樣品的相對分子質量分布圖Figure 2 Relative molecular mass distribution of polysaccharide samples

2.5 體外降血糖活性

2.5.1 對α-淀粉酶的抑制作用 如圖3所示，在試驗范圍內，所有樣品對α-淀粉酶抑制效果均隨質量濃度的增大而增加，說明各樣品對α-淀粉酶的抑制率均存在一定的劑量依賴性。1.0 mg/mL時，APEL-1和APEL-2對α-淀粉酶的抑制率接近陽性對照組(阿卡波糖)的，表明這2種多糖組分對α-淀粉酶的抑制作用較好；堿提西番蓮葉多糖及其組分對α-淀粉酶抑制作用強弱順序為APEL-2>APEL-1>APEL>APEL-3，其中APEL-2對α-淀粉酶的抑制作用最強，最高達到39.21%。

2.5.2 對α-葡萄糖苷酶的抑制作用 如圖4所示，隨質量濃度的增大，各樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性逐漸升高。與陽性對照相比，堿提西番蓮葉多糖及其組分對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均低于阿卡波糖，其中APEL-1對α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高，為63.89%。APEL經過分離后，APEL-1和APEL-3對α-葡萄糖苷酶的抑制效果均高于分離前多糖APEL，而APEL-2對α-葡萄糖苷酶的抑制能力最低；推測可能與其單糖組成及相對分子質量不同有密切關系[25]。

表3 樣品各峰對應的相對分子質量

圖3 多糖樣品對α-淀粉酶的抑制作用Figure 3 Effects of polysaccharide on α-amylase

圖4 多糖樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Figure 4 Inhibition of α-glucosidase by polysaccharide sample

2.6 體外抗凝血活性

如表4所示，與生理鹽水相比，隨著質量濃度的增加，堿提西番蓮葉多糖及其組分均明顯延長了APTT的時間(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴性，尤其是APEL，在質量濃度為100 μg/mL時，APEL的APTT凝血時間是生理鹽水的4.82倍，說明堿提西番蓮葉多糖組分是通過參與內源性凝血途徑來發揮抗凝血作用。多糖中的糖醛酸含量會影響其抗凝血效果，糖醛酸含量高，抗凝效果好[26]；在多糖理化性質中，APEL和APEL-2的糖醛酸含量高，而單糖組成分析中這兩種多糖的半乳糖醛酸含量都較大，所以APEL和APEL-2相比于生理鹽水具有較好的抗凝效果。

如表5所示，與生理鹽水相比，質量濃度為5～100 μg/mL 時，所有多糖樣品對PT的影響均達到顯著性水平(P<0.05或P<0.01)，各多糖樣品組對PT時間均有明顯延長作用，表明西番蓮葉中多糖組分也通過外源性發揮抗凝血效果；其中，APEL-2在0～50 μg/mL時對PT基本沒有影響，而100 μg/mL時可以顯著延長PT，延長了30.53%。研究表明，當肝素鈉分子量在1 000～10 000 Da 時，肝素鈉的抗凝血效果較弱[27]；而多糖的分子量也可能影響抗凝功能，分子量過小，無抗凝血能力[28]，APEL、APEL-1、APEL-2和APEL-3均為分子量很大的多糖，所以均具有較好的抗凝血活性。

如表6所示，堿提西番蓮葉多糖及其組分對TT也有延長作用，但與肝素鈉相比，其增長幅度極小，各多糖樣品要達到相同的抗凝血作用則需要更高的濃度，因此推測其可能不是通過共同途徑來影響凝血過程。而有研究[29]發現，含有硫酸基的多糖均表現出較好的抗凝血活性；肝素鈉本身是一種硫酸氨基葡萄糖鈉鹽，因此肝素鈉會表現出比多糖較好的抗凝血效果。半乳糖是黏附分子凝集素家族識別的配體，與凝集素結合后，阻斷了凝集素在血栓形成中的粘附作用，從而達到抗凝血的效果；崔瑩瑩等[30]發現堿提大蒜多糖組分中的半乳糖構成比例較大，可能是其具有抗凝血活性的原因；單糖組成分析發現堿提西番蓮葉多糖組分都存在半乳糖，推測其抗凝血活性可能與半乳糖含量有關。

3 結論

試驗結果表明，堿提西番蓮葉多糖及其組分具有典型的多糖特征吸收峰，均含有阿拉伯糖和半乳糖，且堿提西番蓮葉多糖及其堿洗脫組分為單峰，多糖組分對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，主要是多糖鏈上含有羥基和羧基，可以與消化酶的氨基酸殘基結合，從而抑制酶的活性，并且堿提西番蓮葉多糖及其組分對α-淀粉酶活性的抑制率大小順序與糖含量的一致，說明其抑制作用與糖含量呈正相關。抗凝血試驗顯示，堿提西番蓮葉多糖及其組分均顯著延長活化部分凝血活酶時間和凝血酶原時間，呈現非常好的抗凝血作用；尤其在質量濃度為100 μg/mL時，堿提西番蓮葉多糖及其堿洗脫組分分別顯著延長活化部分凝血活酶時間和凝血酶原時間，凝血時間分別達到生理鹽水的4.82倍和1.68倍，說明其通過內外源性凝血途徑達到抗凝效果。綜上所述，堿提西番蓮葉多糖明顯具有潛在的降血糖和抗凝血作用。后續將進一步探索堿提西番蓮葉多糖的體內降血糖和抗凝血活性機制，對其他功能活性如抗血栓等方面進行研究。

表4 多糖樣品對APTT的影響?

表5 多糖樣品對PT的影響?

表6 多糖樣品對TT的影響?