高效液相色譜法同時測定柚子中的4種黃酮苷和檸檬苦素

張 珊 黃雪松

(暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632)

二氫黃酮類化合物(包括蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷)[1]和三萜內酯化合物檸檬苦素均為柚子中的活性成分，其中柚皮苷和檸檬苦素為苦味物質，前者造成“直接”苦味，后者呈現“后苦”現象[2-3]，兩類物質的含量是衡量柚子加工產品質量和保健功效的重要品質指標，因此兩類物質的測定方法成為相關領域研究的熱點。

但現有標準及報道中，這兩類物質都是分別測定的，如：GB 1886.262—2016僅規定了柚皮苷的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)測定方法；NY/T 2014—2011規定了同時測定橙皮苷、柚皮苷的HPLC方法；朱露等[4]提出同時測定枳實中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的HPLC方法；蔡艷芳等[5]提出測定枳實中檸檬苦素的HPLC方法，迄今尚未見檸檬苦素與黃酮類物質同時測定的報道。試驗擬以柚子幼果和柚子果汁為樣品，研究一種方便、快速、準確且同時測定蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素5種成分的HPLC方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白肉蜜柚幼果(直徑小于5 cm)、白肉蜜柚：廣東順興種養股份有限公司；

蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷標準品：成都普菲生物技術有限公司；

柚皮苷標準品：上海麥克林生化科技有限公司；

檸檬苦素標準品：上海源葉生物科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純：瑞典歐森巴克化學公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀：LC-20A nence型，配SPD-M20A紫外檢測器，島津(廣州)檢測技術有限公司；

冷凍干燥機：SCIENTZ-10N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

二兩裝高速中藥粉碎機：111型，瑞安市永歷制藥機械有限公司；

高速離心機：HC-3514型，安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品溶液制備 精確稱取一定量的蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷分別用甲醇溶解于50 mL容量瓶中并定容，制成質量濃度分別為1.053，1.363，1.102，1.096 g/L的單標溶液，測定其出峰時間及紫外吸收光譜。

精確稱取一定量蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素，用甲醇溶解于同一50 mL容量瓶中并定容，制成質量濃度分別為1.080，1.146，1.104，1.176，0.812 g/L 的混標母液，用甲醇倍比稀釋至0.50，0.25，1.25×10-1，6.25×10-2，3.13×10-2，1.56×10-2，7.81×10-3，3.91×10-3，1.95×10-3，9.77×10-4倍，測定其濃度。

1.3.2 樣品制備 精確稱取凍干柚子粉末(100目)樣品0.107 7 g于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，超聲提取30 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾，待測。

取新鮮柚子以果肉榨汁，取1 g柚子汁溶于10 mL甲醇，超聲提取30 min后，6 000 r/min離心10 min，取上清液，將上清液與甲醇(V上清液∶V甲醇)以1∶50的比例再次混合，靜置30 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾后待測。

1.3.3 HPLC梯度洗脫方法 參考朱露等[4]和蔡艷芳等[5]的方法，設計如表1中的5種方法。根據所獲HPLC色譜圖從中選出最適宜的方法予以評價。

1.3.4 HPLC測定條件 色譜柱Bio-Bond 5 μm C18(4.6 mm×250 mm)；流動相為乙腈(A)和水(B)，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫40 ℃。配二極管陣列紫外檢測器(PDA)，分別在283 nm和220 nm檢測4種黃酮苷和檸檬苦素。

混標溶液洗脫條件由表1中的5種洗脫方法逐個試用，單標溶液洗脫條件和柚子樣品的洗脫條件為表1中選取的最優方法。

1.3.5 重復性的測定 取1.3.2中的供試品溶液，制成平行樣品5份，以1.3.4中的HPLC條件進行測定，每份樣品連續進樣3次，記錄峰面積，分別計算5種成分的含量和相對標準偏差(RSD)。

1.3.6 精確度與加樣回收率的測定 精密稱取201.5 mg柚子幼果粉末，置于50 mL容量瓶中，分別加入不同質量的5種標準品，定容。以1.3.2中的方法處理后，制成平行樣品5份，在1.3.4中的HPLC條件下進行測定，每份樣品連續進樣3次，記錄峰面積，按式(1)計算平均回收率。用平均回收率和相對標準偏差(RSD)評價精確度高低。

(1)

式中：

R——回收率，%；

m1——測得量，mg；

m2——樣品中成分質量，mg；

m3——加標量，mg。

2 結果與分析

2.1 測定條件的確定

2.1.1 測定波長 圖1分別為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的紫外吸收光譜圖。由圖1(a)～(d)可知，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的最大吸收波長分別為282，282，283，283 nm，為操作與計算方便，選取283 nm為4種黃酮苷的紫外吸收波長。由圖1(e)可知，當檢測波長<240 nm時，波長越小，檸檬苦素的響應值越大，但考慮到既能檢測到檸檬苦素又盡可能減少雜質或溶劑導致的紫外吸收誤差，選擇220 nm 為測定檸檬苦素的吸收波長。據此，定量測定上述5種成分時，檸檬苦素選擇采用220 nm時的吸收峰面積，而4種黃酮則采用283 nm測定時的吸收峰面積。

表1 5種不同的洗脫程序

圖2(a)～圖2(e)分別為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的單標在方法5的洗脫程序下所獲色譜圖，圖2(f)和圖2(g)為上述5種物質的混標在方法5的洗脫程序下所獲色譜圖。由單標和混標的出峰時間對比分析可知，圖2(f)和圖2(g)中峰1～5分別為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素。

圖1 4種黃酮苷和檸檬苦素的紫外吸收光譜圖Figure 1 UV absorption spectra of four flavonoid glycosides and limonin

1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖2 5種標準品在283 nm和220 nm處的色譜圖Figure 2 Chromatograms of 5 standards at 283 nm and 220 nm

2.1.2 最佳HPLC梯度洗脫條件 如圖3所示，逐步提高流動相中乙腈比例，可使檸檬苦素的出峰時間提前。檸檬苦素出峰時間由方法1中21.15 min提前至方法5中15.84 min[圖2(g)]，提前了5.31 min，這是因為C18反相色譜柱的填料以硅膠為基質，表面鍵合有極性相對較弱的官能團。因此，選擇系統洗脫時間最短的方法5測定4種物質；在該條件下，各成分的分離度均大于1.5，滿足測定要求[6]。

2.2 測定方法的可靠性

2.2.1 標準曲線、線性范圍、檢測限和定量限 在1.3.4的條件下，對不同質量濃度的4種黃酮苷與檸檬苦素標準品進行測定。以各組分的峰面積為縱坐標(y)，對應質量濃度為橫坐標(x)繪制標準曲線，得到5種物質的線性方程(見表2)。信噪比(S/N)為3時所對應的質量濃度即為檢出限(LOD)，信噪比為10時對應的質量濃度為定量下限(LOQ)[7]。

2.2.2 重復性 按照1.3.5的處理方法，得出表3的重復性進樣結果，其相對標準偏差(RSD)均小于2%，表明此種方法重復性良好。

2.2.3 精確度與加樣回收率 按照1.3.6的處理方法，得出表4中一系列結果，5種成分的平均回收率范圍為98.47%～99.81%，RSD均小于2%，表明此種方法測量精確，回收率良好。

2.3 柚子幼果與柚子汁中5種物質的含量

根據上述測定方法與標準曲線，測定按照1.3.5準備的柚子樣品，測得柚子幼果(圖4)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的質量分數分別為8.49%，8.05%，1.30%，1.31%，1.46%；測得柚子汁(圖5)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的質量分數分別為1.41%，2.63%，0.23%，0.16%，0.78%。

1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖3 不同洗脫條件下的色譜圖(220 nm)Figure 3 Comparison of tailing of limonoid peaks under different elution conditions (220 nm)

表2 5種成分的標準曲線、相關系數、線性范圍、檢出限、定量限?

由圖4、圖5可知：4種黃酮物質分離度高，峰型好；但檸檬苦素峰型受到樣品中雜質的影響，有一定的偏差，需要注意選擇積分曲線；由表5可知：不同品種、不同生長期和不同部位的柑橘作物中成分質量分數各不相同。

盡管如此，通過上述方法一次測定且同時獲得上述5種成分的含量是非常方便的。此前，人們或分為2～3次分別測量5種物質，或僅測其中的3～4種，試驗所建立的HPLC方法可方便地同時測得其含量，為測定柑橘水果中類黃酮和苦味物質節約大量的成本與時間。

表3 5種成分的重復進樣結果

表4 5種成分的加樣回收率?

1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖4 柚子幼果在283 nm和220 nm處的色譜圖Figure 4 Chromatograms of young pomelo sample solution at 220 nm and 283 nm

1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖5 柚子汁在283 nm和220 nm處的色譜圖Figure 5 Chromatograms of young pomelo sample solution at 283 nm and 220 nm

表5 不同柚子品種與部位的5種成分質量分數

3 結論

試驗建立的高效液相色譜法在20 min內，利用PDA檢測器在283 nm與220 nm分別完成了對柚子幼果及柚子果汁中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素5種關鍵的黃酮類和苦味物質的同時定量測定，測得柚子幼果中5種成分的質量分數分別為8.49%，8.05%，1.30%，1.31%，1.46%，柚子果汁中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的質量分數分別為1.41%，2.63%，0.23%，0.16%，0.78%。但最終確定的方法中，新橙皮苷與檸檬苦素峰[圖2(g)]之間的時間間隔仍然較長，后續可使用不同流動相組分或洗脫方法予以減少。