尿毒營養(yǎng)合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

楊 亮，曾 真，李正勝，樸春梅，周訓(xùn)蓉

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003）

全球慢性腎臟病（CKD）患者數(shù)量呈增長趨勢，已成為威脅人類健康的重要疾病之一［1］。CKD 導(dǎo)致的高磷血癥和一些慢性磷酸鈣穩(wěn)態(tài)紊亂，統(tǒng)稱CKD 相關(guān)礦物質(zhì)及骨代謝紊亂（CKD-MBD），是CKD 的主要并發(fā)癥，嚴(yán)重影響血液透析患者的預(yù)后［2-3］。目前，西醫(yī)的診療方案不能完全改善CKD-MBD 狀態(tài)［4］。尿毒營養(yǎng)合劑為我院醫(yī)院制劑，根據(jù)CKD-MBD 患者脾腎虧虛、濁毒內(nèi)蘊(yùn)、血絡(luò)瘀阻的病機(jī)特點(diǎn)，以黃芪、白術(shù)、黨參、山藥益氣健脾，茯苓、薏苡仁健脾利濕，地錦草、大黃瀉火解毒，建曲消食和胃，肉蓯蓉、黃精補(bǔ)腎填精，縱觀全方，既補(bǔ)后天之脾氣，亦補(bǔ)先天之腎精，化瘀泄?jié)幔a(bǔ)瀉兼施，使脾氣健運(yùn)，胃復(fù)和降，腎精充盈，諸證自除。前期臨床研究表明，該制劑可改善維持性血液透析患者礦物質(zhì)和骨代謝狀況及中醫(yī)臨床癥狀積分［5］。本研究中采用薄層色譜（TLC）法定性鑒別黃芪、茯苓、白術(shù)和山藥，采用高效液相色譜（HPLC）法測定君藥黃芪主要成分黃芪甲苷的含量［6］，為尿毒營養(yǎng)合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀，包括蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），均購自美國 Agilent 公司；MS105DU 型電子天平（瑞士 Mettler Toledo 公司）；KQ-500DA 型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4 型恒溫水浴鍋（江蘇省常州澳華儀器有限公司）；TG-18 型高速離心機(jī)（山東博科生物有限公司）。

1.2 試藥

尿毒營養(yǎng)合劑（批號分別為 160501，160502，160503），缺黃芪、茯苓、白術(shù)、山藥的陰性樣品，均由醫(yī)院制劑室提供；黃芪甲苷對照品（批號為110781-201616，含量為97.4%），黃芪對照藥材（批號為 120974-201612），茯苓對照藥材（批號為121117-201502），白術(shù)對照藥材（批號為120925-201610），山藥對照藥材（批號為121137-201504），均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠、浙江臺州黃巖區(qū)路橋生化塑料廠）；硅膠HSG 薄層板（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃芪

取樣品適量，12 000 r／min 離心 5 min，取上清液約25 mL，加水20 mL，混勻，用正己烷振搖提取2 次，每次40 mL，棄去正己烷液，合并水液；用水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次40 mL，合并水飽和的正丁醇液；用氨試液洗滌2 次，每次50 mL，合并水飽和的正丁醇液；用水洗滌2 次，每次50 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液［7］。取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的對照品溶液。取黃芪對照藥材粉末2 g，精密稱定，同法制備對照藥材溶液。取缺黃芪的陰性樣品適量，同法制備陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（四部）》通則0502 項下方法試驗［8］，分別量取上述 4 種溶液各 10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷 -甲醇 -水（13 ∶7 ∶2，V ／ V ／ V）5 ～10 ℃條件下放置12 h 的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液及對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾［9-10］，詳見圖1 A。

2.1.2 茯苓

取樣品適量，12 000 r／min 離心 5 min，取上清液約25 mL，加水20 mL，混勻，用正己烷振搖提取2 次，每次40 mL，合并正己烷液，揮干，殘渣加正己烷1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取茯苓對照藥材1 g，精密稱定，加水適量，煎煮30 min，放冷，濾過，同法制備對照藥材溶液。取缺茯苓的陰性樣品適量，同法制備陰性對照品溶液［11］。按 2015 年版《中國藥典（四部）》通則 0502 項下方法試驗，分別量取上述3 種溶液各20 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60 ～ 90 ℃ ）- 乙醚（1 ∶1，V ／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾［9-10］，詳見圖1 B。

2.1.3 白術(shù)

取樣品適量，12 000 r／min 離心 5 min，取上清液約25 mL，用乙酸乙酯振搖提取2 次，每次40 mL，合并乙酸乙酯液，揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取白術(shù)對照藥材1 g，精密稱定，加水適量，煎煮30 min，放冷，濾過，同法制備對照藥材溶液。取缺白術(shù)的陰性樣品適量，同法制備陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（四部）》通則 0502 項下方法試驗［7］，分別量取上述3 種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷 - 乙酸乙酯（9 ∶1，V ／ V）為展開劑［12］，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾［9-10］，詳見圖 1 C。

2.1.4 山藥

取樣品適量，12 000 r／min 離心 5 min，取上清液約25 mL，用三氯甲烷振搖提取2 次，每次40 mL，合并三氯甲烷液，揮干，殘渣加三氯甲烷1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取山藥對照藥材1 g，精密稱定，加水適量煎煮30 min，放冷，濾過，同法制備對照藥材溶液。取缺山藥的陰性樣品適量，同法制備陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（四部）》通則 0502 項下方法試驗［7］，分別量取上述3 種溶液各10μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷 -乙酸乙酯（12 ∶1，V ／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰［13］。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，詳見圖1 D。

2.2 含量測定［8］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -水（34 ∶66，V ／ V）；流速：1 mL ／min；檢測器：ELSD；柱溫：30 ℃ ；漂移管溫度：60 ℃［8］。

2.2.2 溶液制備

取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含黃芪甲苷0.8 mg 的溶液，即得對照品溶液。取2.1.1 項下供試品溶液，置5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液［14］。按尿毒營養(yǎng)合劑處方及工藝制備缺黃芪的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖2。結(jié)果理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計應(yīng)不低于3 000，分離度均大于4 000。

專屬性試驗：取2.2.2 項下對照品溶液及陰性對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖2。結(jié)果陰性對照品溶液色譜圖中，在與黃芪甲苷對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。

線性關(guān)系考察：取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.865 3 mg／mL 的對照品溶液，精密量取 1，2，5，10，20 μL，按 2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以黃芪甲苷進(jìn)樣量的自然對數(shù)值（X）為橫坐標(biāo)、峰面積自然對數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y ＝1.5413X-3.7802（r ＝0.9950）。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量在 0.87 ～ 17.31 μg 范圍內(nèi)的自然對數(shù)值與峰面積自然對數(shù)值線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取 2.2.2 項下對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果黃芪甲苷峰面積自然對數(shù)值的 RSD 為0.23%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0，1，4，8，13，20，40 h 時按 2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果黃芪甲苷峰面積的RSD 為 0.84% （n ＝ 7），表明供試品溶液在室溫放置40 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為160501）適量，精密稱定，共 6 份，按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果黃芪甲苷含量平均值為0.031 35 mg／mL，RSD為 2.90%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為160501）適量，共6 份，分別加入一定質(zhì)量濃度的黃芪甲苷對照品溶液，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Results of recovery tests（n ＝ 6）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品各適量，分別按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品中黃芪甲苷含量測定結(jié)果（mg／mL，n ＝2）Tab.2 Results of content determination of astragaloside Ⅳ in the samples（mg ／mL，n ＝ 2）

3 討論

預(yù)試驗中比較了樣品加乙醚振搖及樣品濃縮加硅藻土，以甲醇、水飽和的正丁醇分別加熱回流提取樣品前處理方法，結(jié)果均出現(xiàn)斑點(diǎn)分離不佳、拖尾嚴(yán)重或提取過程乳化較嚴(yán)重的現(xiàn)象。參考文獻(xiàn)［15］考察展開劑，黃芪TLC 鑒別中考察了三氯甲烷 -甲醇 -水（30 ∶10 ∶1，V ／ V ／ V）和三氯甲烷 - 甲醇（10 ∶1，V ／ V），茯苓 TLC 鑒定考察了石油醚（60 ～90 ℃ ）-乙醚（3 ∶2，V ／ V）和石油醚（60 ～ 90 ℃ ）- 乙酸乙酯（1 ∶1，V ／ V），白術(shù) TLC 鑒別中考察了石油醚（60 ～90 ℃ ）-乙酸乙酯（5 ∶1，50 ∶1，V ／ V），山藥 TLC 鑒定考察了正丁醇 -冰醋酸 -水（4 ∶1，V ／ V）和乙酸乙酯 -甲醇 -濃氨試液（9 ∶1 ∶0.5，V／ V／ V），結(jié)果均欠佳。TLC 耐用性分別考察了25 ℃下不同相對濕度（35%，59%，75%），以及相對濕度59%時不同溫度（10，25，35 ℃）對 TLC 結(jié)果的影響，結(jié)果文中所用定性鑒別方法耐用性均較好。

黃芪甲苷作為尿毒營養(yǎng)合劑方中君藥黃芪的有效成分［16］，因其無紫外吸收的結(jié)構(gòu)特性，提取純化及檢測方法較其他成分更復(fù)雜。預(yù)試驗中，供試品溶液制備方法對比了加硅藻土、乙醚、振搖提取結(jié)果。色譜條件考察了不同廠家 C18柱，不同流動相［乙腈 - 水（32 ∶68，V ／ V）和0.1%甲酸（冰醋酸）-乙腈等］的流動性，不同柱溫（30，35，40 ℃），不同漂移管溫度（50，60，70 ℃）對含量測定結(jié)果的影響。結(jié)果黃芪甲苷分離度欠佳，陰性樣品中某些成分存在干擾，最終建立了文中所用制備方法及色譜條件。

綜上所述，該研究所建立的方法可用于尿毒營養(yǎng)合劑的質(zhì)量控制。