瓜蔞當歸降脂顆粒質量標準研究*

李 媛，朱建勇，顧偉鷹，時扣榮，劉 娟，張春燕，羅 蘭

（上海中醫藥大學附屬第七人民醫院，上海 200137）

瓜蔞當歸降脂方由當歸、瓜蔞、澤瀉、決明子、山楂5 味中藥組方，為上海市名老中醫葉景華教授的經驗方，臨床應用20 余年，對高脂血癥有顯著療效。其臨床應用劑型為湯劑，保質期短，口感欠佳，服用不便，且不便于貯存和運輸。運用現代技術將其劑型由湯劑改為顆粒劑，對于該方的臨床應用有積極意義。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對制劑中當歸、決明子、山楂進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定阿魏酸及橙黃決明素的含量，為建立瓜蔞當歸降脂顆粒的質量標準提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；BD-Ⅱ型多功能紫外分析儀（北京啟航博達有限公司）；CP225D 型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；DL720-A 型超聲清洗儀（上海之信儀器有限公司）；HWS28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；SHZ-DⅢ型循環水式真空泵（鄭州博科設備有限公司）；DNG-9140A 型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；RV-10 型旋轉蒸發儀（德國IKA公司）。

1.2 試藥

瓜蔞當歸降脂顆粒（醫院制劑，批號分別為20190901，20190902，20190903）；熊果酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為L03A6Y1，含量≥98%）；阿魏酸對照品（批號為110773-201614，含量≥98%），橙黃決明素對照品（批號為111900-201605，含量≥98%），大黃酚（批號為110796-201922，含量≥98%），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水；瓜蔞、當歸、澤瀉、決明子、山楂藥材均購于上海康橋藥業有限公司，經上海市第七人民醫院藥劑科副主任中藥師公丕君鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

決明子［1-3］：取樣品 10 g，加水 100 mL，超聲（功率600 W，頻率 40 kHz，下同）處理30 min，濾過，取續濾液50 mL，加入鹽酸1 mL，用50 mL 水飽和正丁醇振搖提取2 次，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取橙黃決明素、大黃酚對照品各適量，加無水乙醇 -乙酸乙酯（2 ∶1，V ／ V），制成質量濃度均為1 mg／mL 的單一對照品溶液。按瓜蔞當歸降脂顆粒處方工藝制備缺決明子的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（一部）》通則0502 項下方法試驗，分別取上述4 種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠 GF254薄層板上，以石油醚 - 丙酮（2 ∶1，V ／ V）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

當歸［4-5］：取樣品 10 g，加水 100 mL，超聲處理 30 min，濾過，取續濾液50 mL，加入鹽酸1 mL，用100 mL 二氯甲烷振搖提取2 次，合并萃取液，蒸干，殘渣加1 mL 甲醇使溶解，作為供試品溶液。取阿魏酸對照品，加甲醇制成質量濃度為1 mg／mL 的對照品溶液。按瓜蔞當歸降脂顆粒處方工藝制備缺當歸的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（一部）》通則0502 項下方法試驗，分別取上述3 種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 - 甲酸（4 ∶2 ∶2 ∶0.1，V ／ V ／ V ／ V）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

山楂［6-8］：取樣品 10 g，加水 100 mL，超聲處理30 min，濾過，取續濾液50 mL，用石油醚振搖提取2 次，每次100 mL，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取熊果酸對照品，加甲醇制成質量濃度為1 mg／mL 的對照品溶液。按瓜蔞當歸降脂顆粒處方工藝制備缺山楂的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（一部）》通則0502 項下方法試驗，分別取上述3 種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠 GF254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20 ∶4 ∶0.5，V ／ V ／ V）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下及紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件［9-14］

色譜柱：Agligent C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（洗脫程序見表 1）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：284 nm；進樣量：10 μL；柱溫：25 ℃。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs of the mobile phase

2.2.2 溶液制備

精密稱取阿魏酸、橙黃決明素對照品各適量，加50%甲醇溶解，制成阿魏酸、橙黃決明素質量濃度分別為10，20 μg ／mL 的混合對照品溶液。取樣品約 1.5 g，精密稱定，加入50%甲醇25 mL，超聲處理10 min，放冷至室溫，補足減少的體積，經0.45 mm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按瓜蔞當歸降脂顆粒處方工藝制備缺當歸、決明子的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取 2.2.2 項下 3 種溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖 2。結果顯示，陰性對照品溶液在與阿魏酸、橙黃決明素對照品溶液相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。

線性關系考察：分別精密量取2.2.2 項下混合對照品溶液 1，2.5，5，10，15，20 μL，按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（X，μL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得阿魏酸、橙黃 決 明 素回歸方程 Y1＝1 638.542 6X1+1.415 6（r1＝0.999 7），Y2＝ 819.271 3 X2+1.415 6（r2＝ 0.999 7）。結果，阿魏酸、橙黃決明素進樣量分別在 0.01 ～0.20 μg和 0.02 ～ 0.40 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果阿魏酸、橙黃決明素峰面積的 RSD 分別為0.25%和 0.50%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0，2，10，18，24 h 時按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果，阿魏酸、橙黃決明素峰面積的 RSD分別為 1.92%和 0.99%（n ＝ 5），表明供試品溶液在室溫放置24 h 內基本穩定。

重復性試驗：稱取樣品（批號為20190901）適量，精密稱定，按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果阿魏酸、橙黃決明素平均含量分別為1.67%和6.09% ，RSD 分別為 0.37% 和 0.34% （n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20190901）適量，共6 份，分別加入一定質量濃度的對照品溶液，按 2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n ＝6）Tab.2 Results of recovery tests（n ＝ 6）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品各適量，分別按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果見表3。

3 討論

本研究中當歸、決明子、山楂的TLC 鑒別主要參考2015 年版《中國藥典（一部）》的方法［15］。當歸的 TLC鑒別中，藥典采用乙醚提取當歸藥材中的阿魏酸，在樣品的制備過程中考慮到安全性及阿魏酸的物理性質，先用鹽酸調酸性，再用二氯甲烷分步萃取，作為供試品溶液。藥典以環己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4 ∶1 ∶1 ∶0.1，V ／ V ／ V ／ V）為展開劑，本研究中采用應用范圍較廣的石油醚代替環己烷，并將比例調整為4 ∶2 ∶2 ∶0.1（ V ／ V ／ V ／ V），熒光斑點顯色清晰，分離度效果較好。決明子的TLC 鑒別中，藥典采用乙醚提取，后以三氯甲烷溶解。鑒于2 種試劑的安全性差，以及結合橙黃決明素的物理性質，本研究中采用正丁醇提取，制備供試品溶液，結果表明該制備方法可行，效果良好。山楂的TLC 鑒別中，預試驗中分別用乙酸乙酯和石油醚萃取，前者干擾雜質較多不易分離，而采用石油醚萃取后制備供試品溶液，效果較好。

表3 樣品中阿魏酸、橙黃決明素含量測定結果（mg／g，n ＝3）Tab.3 Results of content determination of ferulic acid and aurantio-obtusin in the samples（mg ／g，n ＝ 3）

初期根據處方中藥材的化學成分及藥理作用對含量測定指標進行選擇。瓜蔞藥材中3，29-二苯甲酰栝樓仁三醇，澤瀉藥材中23-乙酰澤瀉醇B 的溶解性較差［16］，不適合作為該制劑的質量控制指標，故選擇當歸藥材中的阿魏酸及決明子藥材中的橙黃決明素作為檢測指標。

HPLC 法測定含量方面，本研究中采用同一波長，同時檢測2 種成分的方法［17］，梯度洗脫時間設定在40 min 時2 種成分保留時間相差較大，峰形良好且分離度佳，各組分互不干擾，方法簡單、易行，結果可靠。

樣品中橙黃決明素的含量為1.25 mg／g，雖略超線性范圍，但因橙黃決明素的線性關系良好，仍認為制備的樣品穩定。

本研究中建立了瓜蔞當歸降脂顆粒中3 種藥材的TLC 定性鑒別方法和2 種有效成分的含量測定方法，方法簡便可行，靈敏度高，準確度高，重復性好，可用于瓜蔞當歸降脂顆粒的質量控制。