酒萸肉超高效液相色譜指紋圖譜的建立及化學計量分析*

李永鵬，卜晨琛，宋 霞，劉亞蓉

（青海省藥品檢驗檢測院·青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，青海 西寧 810000）

山茱萸有補益肝腎、收澀固脫功效，臨床用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸軟、陽痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內(nèi)熱消渴等癥［1］。山茱萸經(jīng)酒炮制后補益功能增強，六味地黃丸、知柏地黃丸等經(jīng)典名方均以酒萸肉為原料［2-3］，但 2015 年版《中國藥典 （一部 ）》尚未區(qū)分山萸肉和酒萸肉的質(zhì)控指標。為了全面評價酒萸肉的質(zhì)量和現(xiàn)行標準的可行性，本研究中采用超高效液相色譜（UPLC）法測定酒萸肉多指標成分的含量，并建立指紋圖譜，為酒萸肉的臨床應用、炮制和資源開發(fā)提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；BSA224SCW 型電子分析天平（德國Sartorius 公司，精度為十萬分之一）；N-1001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化機械株式會社）；Milli-QA10 型超純水器（德國Merck Millipore 公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；Chempattern 化學計量學軟件（北京科邁恩科技有限公司）。

1.2 試藥

沒食子酸對照品（批號為110831-201605），5-羥甲基糠醛對照品（批號為111626-201610），莫諾苷對照品（批號為111637-201609），馬錢苷對照品（批號為111640-201707），獐牙菜苷對照品（批號為111742-200501），含量均大于98%，均購自中國食品藥品檢定研究院；山茱萸新苷對照品（上海科哲生物科技有限公司，批號為Y14M10H88277，含量＞98%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。山茱萸藥材均來自2019 年國家藥品評價性抽驗計劃抽驗樣品，經(jīng)青海藥品檢驗檢測院鑒定為山茱萸科植物山茱萸 Cornus officinalis Sieb.et Zucc. 的干燥成熟果肉，其中 10 批為山萸肉，76 批為酒萸肉（黃酒炮制品）。酒萸肉藥材信息見表1。

2 方法與結(jié)果［4-14］

2.1 色譜條件

色譜柱：ACE3 C18-AR 柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm）；流動相：乙腈（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表 2）；流速：0.2 mL ／min；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：1 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、山茱萸新苷對照品各10 mg，精密稱定，分別置50 mL 容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容，得各單一對照品貯備液；分別取1.0 mL，置同一10 mL 容量瓶中，用80%甲醇定容，即得上述6 種成分質(zhì)量濃度分別為 24.62，35.79，59.16，9.28，43.05，18.09 μg ／mL 的混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品（編號為005）粉末（過3 號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取樣品（編號為005）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定6 次，以馬錢苷峰為參照峰計算。結(jié)果各特征峰相對保留時間的 RSD 小于 1% （ n ＝ 6），單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰相對峰面積的 RSD 小于2%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0，2，4，6，8，12，24 h，按 2.1 項下色譜條件進樣測定，以馬錢苷峰為參照峰計算。結(jié)果各特征峰相對保留時間的 RSD 小于1%（n ＝7），單峰面積占總峰面積的比例大于2%的特征峰相對峰面積的 RSD 小于2%（ n ＝7），表明供試品溶液室溫下放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（編號為005）適量，精密稱定，共 6 份，按 2.2 項下方法制備供試品溶液，再按 2.1 項下色譜條件進樣測定，以馬錢苷峰為參照峰計算。結(jié)果各特征峰相對保留時間的 RSD 小于 1% （ n ＝ 6），單峰面積占總峰面積的比例大于2%的特征峰相對峰面積的 RSD 小于2% （ n ＝6），表明方法重復性良好。

表1 76 批酒萸肉藥材樣品來源和指紋圖譜相似度評價Tab.1 Information about the origin of 76 batches of wine-prepared Fructus Corni and their fingerprint similarity

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs of the mobile phase

2.4 指紋圖譜研究

指紋圖譜建立：取酒萸肉藥材樣品76 批，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，指紋圖譜見圖1。根據(jù)結(jié)果，采用Chempattern 化學計量學軟件分析數(shù)據(jù)，設(shè)編號005 樣品的色譜圖為參照圖譜，其他樣品的色譜峰與參照圖譜進行自動匹配，即得酒萸肉共有模式的對照指紋圖譜，見圖2。將76 批酒萸肉藥材樣品的指紋圖譜均導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012 版），計算相似度，結(jié)果76 批酒萸肉藥材樣品中有60 批的相似度大于0.8，10 批的相似度小于0.7，詳見表1。結(jié)果表明，不同來源酒萸肉存在差異。

圖1 76 批酒萸肉藥材樣品超高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprints of 76 batches of wine-prepared Fructus Corni

特征峰標定：根據(jù)76 批酒萸肉的特征圖譜測定結(jié)果，共標定7 個特征峰。與對照品比對并結(jié)合圖譜可知，1 號峰為沒食子酸，2 號峰為5-羥甲基糠醛，3 號峰為莫諾苷，4 號峰為馬錢苷，5 號峰為獐牙菜苷，7 號峰為山茱萸新苷；6 號峰成分未定。

酒萸肉和山萸肉指紋圖譜比較：取10 批山萸肉藥材樣品粉末，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖3，根據(jù)結(jié)果，采用Chempattern 化學計量學軟件分析數(shù)據(jù)，并計算酒萸肉和山萸肉指紋圖譜的相似度，結(jié)果10 批山萸肉樣品相似度分別為 0.38，0.54，0.60，0.53，0.54，0.56，0.53，0.56，0.54，0.53，詳見圖 4。結(jié)果表明，山茱萸炮制前后的指紋圖譜差異較大。

2.5 化學計量學分析

聚類分析：以各參照峰面積相對峰面積為變量，以Chempattern 化學計量學軟件進行聚類分析，采用誤差平方和法，以歐氏距離為樣品測度，聚類分析結(jié)果見圖5。結(jié)果76 批酒萸肉藥材和10 批山萸肉藥材聚為兩大類，兩大類的5-羥甲基糠醛含量差異明顯。其中有8 批山萸肉（編號分別為 077，142，214，215，249，315，333，334）與酒萸肉聚為一類，兩者相似度均小于0.7，5-羥甲基糠醛峰基本未檢出，提示炮制不到位。

圖4 酒萸肉與山萸肉藥材樣品相似度評價Fig.4 Similarity of wine-prepared Fructus Corni and Fructus Corni

圖5 酒萸肉與山萸肉藥材樣品聚類分析Fig.5 Cluster analysis of wine-prepared Fructus Corni and Fructus Corni

圖6 酒萸肉與山萸肉藥材樣品主成分分析Fig.6 Principle component analysis of wine-prepared Fructus Corni and Fructus Corni

主成分分析：采用Chempattern 化學計量學軟件將76 批酒萸肉藥材樣品和10 批山萸肉藥材樣品的峰面積進行標準化處理，再行主成分分析（見圖6）。結(jié)果編號為 36，176，324，325，xx2 的酒萸肉藥材樣品產(chǎn)生明顯偏離，其余71 批藥材樣品基本聚集在一起。其中6 號峰（未知）對樣品36 和樣品176 偏離貢獻大，2 號峰（5-羥甲基糠醛）對樣品xx2、樣品324、樣品325 的偏離貢獻大；其余個別樣品有向2 號峰偏離，表明2 號峰對酒萸肉影響較大，與聚類分析結(jié)果相一致。

3 討論

采用二極管陣列檢測器在190 ～400 nm 波長范圍內(nèi)對對照品溶液進行全波長掃描，考察了乙腈-磷酸溶液、甲醇-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液、甲醇-甲酸流動相系統(tǒng)不同梯度洗脫條件，對 ACE3 C18- AR 柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm），Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm），Agilent Zorbax RRHD Extend C18柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm）進行了優(yōu)選，篩選 0.1，0.2，0.3，0.4 mL ／ min 的流速，以及 25，30，35 ℃的柱溫，最終按選定色譜條件進樣測定。結(jié)果顯示，各色譜峰信息最多，各成分分離情況良好，可用于酒萸肉的指紋圖譜研究。

利用聚類分析對酒萸肉指紋圖譜進行評價，發(fā)現(xiàn)樣品可分為兩大類，其中48 批藥材樣品聚為一類，28 批藥材樣品聚為第二類。進一步研究共有峰發(fā)現(xiàn)，第二類藥材樣品中5-羥甲基糠醛峰面積較大，提示5-羥甲基糠醛是聚群的主要原因，主成分分析也得到此結(jié)果。在相似度統(tǒng)計中有8 批藥材樣品相似度低于0.7，聚類分析時與山萸肉在一個大類中，提示炮制不到位。進一步進行主成分分析發(fā)現(xiàn)，5-羥甲基糠醛對其偏離貢獻較大，與聚類分析結(jié)果相呼應。5-羥甲基糠醛為山萸肉酒制后得到的新產(chǎn)物，其含量反映炮制工藝的穩(wěn)定性及優(yōu)良性，酒萸肉炮制方法為取凈山萸肉，用黃酒拌勻，待酒被吸盡后，裝罐內(nèi)密封隔水燉或置蒸器內(nèi)蒸制，用武火加熱至山萸肉色變黑潤，而5-羥甲基糠醛偏離的8 批藥材樣品顏色均未達到黑潤，原因為炮制時間不足［15］，需在酒萸肉質(zhì)量控制中加以注意。

綜上所述，該研究所建立的超高效液相色譜指紋圖譜可為酒萸肉的質(zhì)量評價提供參考。