復方連翹滴鼻液制備工藝優化及質量控制

金偉華，于波濤 ，張 明 ，蒲志強，龔 嬋

（1. 中國人民解放軍西部戰區總醫院藥劑科，四川 成都 610083； 2. 川北醫學院藥學部，四川 南充 637000）

連翹為木犀科植物連翹的干燥果實，具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱功效［1］。藥理學研究表明，連翹具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、解熱鎮痛等作用［2］。連翹苷是連翹的主要藥理活性成分之一［3］。以連翹為原料藥，目前已開發出許多成方制劑，包括中成藥鼻用制劑，如復方連翹滴鼻液，其主要由連翹、板藍根、蘆根、郁金、地黃、知母、廣藿香等藥材提取制成，通過鼻黏膜吸收，用于防治病毒性感冒、病毒性肝炎、扁桃體炎等。本研究中探討了其提取工藝及質量控制，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200 型高效液相色譜儀（美國 Agilent 公司）、AB135-S 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為 0.01 mg）；PHS-3C 型精密 pH 計（上海康儀儀器有限公司）；AP-01P 型真空泵（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；GT-2013QTS 超聲波清洗機（廣東固特超聲股份有限公司）。

1.2 試藥

復方連翹滴鼻液（批號分別為20190406，20190410，20190411，20190412）及各陰性樣品均由中國人民解放軍西部戰區總醫院制劑中心提供；連翹苷對照品（批號PCS0588-180105，含量為98%），菝葜皂苷元對照品（批號PCS1009-170905，含量為98%），均購自成都植標化純生物技術有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 樣品提取

水提工藝篩選：采用 L9（34）正交試驗法，以加水量（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數（C）為考察因素，因素水平見表1。以連翹苷含量為考察指標，通過正交試驗確定最佳的水提工藝條件。正交試驗設計與結果見表2［4］，方差分析結果見表3。由表2 可知，3 個因素對提取工藝的影響強弱依次為C ＞A ＞B；方差分析結果表明，因素C對水提工藝結果有顯著影響。試驗結果表明，最佳的水提工藝為A3B2C3。結合實際情況，現擬訂工藝為加10 倍水，煎煮3 次，每次 1 h［5］。經驗證，該工藝重復性良好，連翹苷平均含量為0.392 mg／mL，說明水提工藝穩定可行。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and their levels

表2 L9（34）正交試驗設計與結果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表3 方差分析結果Tab.3 Results of the variance analysis

醇沉工藝篩選：根據優選的最佳水提工藝，對水提液進行醇沉工藝考察。取上述水提液5 份，每份200 mL，分別加入乙醇，使乙醇體積分數依次達到40%，50%，60% ，70% ，80%，靜置 24 h，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，測定。結果藥液中連翹苷含量分別為0.342，0.346，0.356，0.334，0.326 mg／mL。可見，當乙醇體積分數為60%時，提取后藥液中連翹苷含量最高，因此確定乙醇體積分數為60%。

樣品制備：根據水提和醇沉工藝考察結果，確定復方連翹滴鼻液的制備工藝為：按處方成分量及比例稱取藥材，加10 倍水，分別煎煮 3 次，每次 1 h，合并 3 次煎煮后的濾液，濃縮至相對密度為1.15 ～1.25，加入乙醇，調乙醇體積分數至60%，靜置24 h，濾過，回收乙醇，加水適量，用 50%NaOH 溶液調 pH 至 6 ～ 7，再加入5%羥苯乙酯醇溶液約3 mL，加水定容至1 000 mL，攪勻，分裝，即得。

2.2 定性鑒別

連翹：取樣品20mL，用乙酸乙酯提取2 次，每次20mL，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取連翹苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。取缺連翹的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（四部）》通則 0502“薄層色譜法”項下方法吸取上述3 種溶液各8 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷 - 甲醇（5 ∶1，V ／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

知母：取樣品20mL，用乙醚振搖提取2 次，每次20mL，合并水溶液，用水飽和正丁醇振搖提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加乙醇20 mL 使溶解，加鹽酸2 mL，加熱回流1 h，放冷，加水10 mL，用石油醚（60 ～ 90 ℃）振搖提取 2 次，每次 20 mL，合并石油醚液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取菝葜皂苷元對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。取缺知母的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。吸取上述3 種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯 -丙酮（9 ∶1，V ／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

2.3 連翹苷含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：YMC-Triart C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 - 水（23 ∶77，V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：277 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.3.2 溶液制備

取連翹苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質量濃度為0.183 0 mg／mL 的對照品溶液。精密量取樣品30 mL，加乙酸乙酯振搖提取3 次，每次25 mL，合并乙酸乙酯，蒸干，殘渣加70%甲醇溶解，置100 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。取缺連翹的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學考察［6-11］

系統適用性試驗：精密吸取2.3.2 項下3 種溶液各10 μL，按 2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置有吸收峰，陰性對照無干擾。理論板數按連翹苷峰計應不低于3000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖2。

線性關系考察：取對照品溶液依次稀釋，得質量濃度為0.183 0，0.146 4，0.109 8，0.073 2，0.036 6 mg ／mL 的系列對照品溶液，按2.3.1 項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積，以連翹苷質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y ＝7 159.9X+56.341，r ＝0.9992（n ＝5）。結果，連翹苷進樣質量濃度在 0.0366 ～0.183 0 mg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液適量，按2.3.1 項下色譜條件連續進樣6 次，記錄連翹苷峰面積。結果的 RSD 為 1.05%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號20190406），依法制備供試品溶液，室溫下分別于 0，2，4，8，12，24 h 時進樣，測定峰面積。結果的 RSD 為 2.07% （n ＝ 6），表明供試品溶液室溫放置24 h 內穩定。

重復性試驗：取同一批（批號20190406）樣品，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液 6 份，按 2.3.1 項下色譜條件連續進樣測定。結果連翹苷平均含量為0.314mg／mL，RSD 為 1.53%（n ＝ 6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取連翹苷含量為0.314 mg／mL 的供試品溶液適量，分別加入不同質量濃度的連翹苷對照品溶液，按 2.3.2 項下方法制備供試品溶液，按 2.3.1項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表4。

表4 加樣回收試驗結果（n ＝9）Tab.4 Results of recovery tests（n ＝ 9）

2.3.4 樣品含量測定

取 3 批（批號分別為 20190410，20190411，20190412）樣品適量，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果3 批樣品中連翹苷的含量分別為0.338，0.346，0.342 mg ／mL。

3 討論

3.1 提取工藝優選

該制劑處方提取工藝主要采用水提醇沉法，以連翹苷的提取率為指標，采用正交試驗法優化，篩選最佳提取條件，優選工藝提取的成品質量穩定，且質量標準可控。

3.2 質控藥材選擇

質量標準部分主要包括定性鑒別和含量測定。定性鑒別中，由于處方藥味較少，以水作為提取溶劑，故其中幾味藥材的鑒別試驗未發現特征性斑點或分離效果較差，最終只完成了連翹、知母的定性鑒別。含量測定以連翹苷為指標，預試驗結果表明，以乙腈 - 水（23 ∶77，V ／ V）為流動相、檢測波長為277 nm 時樣品各成分分離效果較好，可有效分離連翹苷與其他成分。方法學考察結果表明，儀器精密度良好，供試品溶液室溫放置24 h 內穩定，方法重復性良好。

3.3 含量限度

工藝確定后，制備3 批供試品，按質量標準檢測方法進樣測定，結果3 批樣品中連翹苷的含量分別為0.338，0.346，0.342 mg ／mL。樣品連翹苷含量的差異主要與藥材中相關成分含量高低有關，因此可根據樣品含量測定結果設定復方連翹滴鼻液中連翹苷含量限度。