辣椒骨中芽孢桿菌的生理生化特性分析

□ 黃毅鋒 陳慶金

（百色學院，農業與食品工程學院，廣西 百色 533000）

辣椒骨是苗家的風味特產，是將過年時所殺豬、牛的骨頭舂爛，拌上各種香料，置于壇內密封半月后食用的特色美食[1-2]。辣椒骨的加工實際是環境中微生物和原料中酶作用的過程。在豬肉制品加工中，多項研究得出肉發酵后，氨基態氮、多肽含量。本文對從辣椒骨中分離的菌株進行分析，主要通過形態學實驗、糖發酵實驗、吲哚實驗、甲基紅實驗、最適生長條件等進行初步鑒定，為研究微生物與辣椒骨品質形成的關系奠定理論基礎。

一、材料與方法

（一）材料與試劑

1.1 材料

分離自辣椒骨的M-4-B1菌株，4℃冰箱保存。

1.2 試劑

草酸銨結晶紫染液、盧戈氏碘液、番紅染液、95%乙醇、75%乙醇、福林酚、無水碳酸鈉、三氯乙酸等。

培養基的配制：

營養瓊脂和營養肉湯培養基：牛肉膏3g，蛋白胨10 g，氯化鈉5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.4～7.6。不加瓊脂即為營養肉湯培養基。

糖發酵培養基：蛋白胨10g，氯化鈉5g，1.6%溴甲酚紫溶液1.5mL，待測糖（葡萄糖、乳糖、蔗糖分別為5 g）蒸餾水1000mL。pH7.0～7.4。

（3）產酶發酵培養基：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏3g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，pH7.0～7.2。

（二）儀器設備

GHP-9050隔水式恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；BH200生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；LRH-100-S恒溫培養箱 韶關市泰宏醫療器械有限公司；電子天平；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實業有限公司；UV-1800紫外可見光分光光度計上海美譜達儀器有限公司。

（三）實驗方法

1.1 形態觀察和生理生化實驗

將菌種M-4-B1接種到營養瓊脂培養基37℃培養24 h，參考《常見細菌系統鑒定手冊》[4]和《微生物學實驗》[5]進行細菌的形態學觀察和糖的氧化發酵實驗、吲哚實驗、甲基紅實驗等生理生化實驗，記錄現象。

1.2 生長條件的研究

1.3.1 溫度對菌株生長的影響

取0.5mL菌株，在無菌操作條件下置于裝有50mL營養肉湯的培養基中，分別于28℃、33℃、37℃、42℃、45℃，轉速為180r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24h，以營養肉湯培養基為空白對照，用分光光度計測定波長600nm處的吸光度值。

1.3.2 pH對菌株生長的影響

將營養肉湯培養基分別用1mol/LNaOH溶液和1 mol/LHCl溶液調pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，取0.5 mL菌株，在無菌操作條件下置于裝有50mL營養肉湯的培養基中，放入溫度為37℃、轉速為180r/min的恒溫振蕩箱中培養24h，以營養肉湯培養基作空自對照，用分光光度計測定波長600nm處的吸光度值。

1.3.3 NaCl濃度對菌株生長的影響

在營養肉湯培養基中加入氯化鈉，使氯化鈉質量分數分別為0.1%、0.5%、1%、3%、5%，在無菌操作條件下加入0.5mL菌液，放入溫度為37℃、轉速為180r/min的恒溫振蕩箱中培養24h，以營養肉湯培養基作空自對照，用分光光度計測定波長600nm處的吸光度值。

1.3 胞外蛋白酶活力

將菌株接入營養肉湯培養基中培養16～18h制備種子液，以5%的接種量將種子液接種至50mL的產酶發酵培養基中，置于37℃、160r/min的培養箱中培養48h，取出裝入離心管，在高速冷凍離心機中以4℃、5000r/min離心20min，取上清液，采用福林酚法測定酶活力。

二、結果與分析

（一）形態學鑒定

圖1的實驗結果，M-4-B1似圓形、乳白色、光滑、鋸齒狀，鏡檢M-4-B1革蘭氏染色呈藍紫色為陽性菌，根據結果查閱《常見細菌鑒定手冊》和第九版《伯杰氏細菌鑒定手冊》，初步鑒定M-4-B1為芽孢桿菌屬。

（二）生理生化鑒定研究

M-4-B1菌株在糖發酵實驗中只產酸，不產氣；在甲基紅實驗產酸不產氣，該菌能分解葡萄糖和蔗糖，不能分解乳糖，吲哚實驗既不產酸也不產氣。

（三）最適生長條件的分析

1.1 溫度對菌株生長的影響

由圖2可知，該菌株適宜生長溫度范圍為28～37℃，45℃生長受到抑制。溫度是影響微生物新陳代謝的重要因素之一，過高的溫度會導致細菌蛋白質變性失活，過低的溫度使細菌的酶活性降低。

1.2 pH對菌株生長的影響

由圖3可知，菌株在pH5～9均可生長，隨著pH升高菌株生長越好，最適生長pH在8.0左右。pH可以反映出菌株對于環境的適應能力，適宜的pH值對菌株生長有重要作用，對于研究細菌的環境承受能力有至關重要。

1.3 NaCl濃度對菌株生長的影響

由圖4可以看出，菌株在鹽濃度為0.1%～5%均可生長，最適鹽濃度為0.5%，當鹽濃度達到5%時對菌株的生長有一定的抑制作用。細胞受離子的影響，過高的鹽濃度會使細胞失水收縮，從而抑制細胞的正常生長甚至細胞死亡，因此培養基中的鹽濃度對細菌的生長有重要作用。

（四）胞外蛋白酶活力

M-4-B1菌株能產生蛋白酶，在40℃，pH為7.0的條件下菌株的產酶活力為28.36μ/g。菌株產生的蛋白酶可以分解肉中的蛋白質，影響產品中多肽和氨基態氮含量，增加產品的風味和營養價值。

三、結論與展望

根據菌落形態、染色結果及鏡檢觀察，初步判斷M-4-B1菌株為芽孢桿菌屬，該菌株最適pH為8.0左右，最適溫度為37℃，最適NaCl濃度為0.5%。此菌株能產生蛋白酶，在40℃，pH為7.0的條件下菌株的產酶活力為28.36μ/g。由于未進行分子生物學鑒定，不能確定到種。目前尚未有關于辣椒骨微生物的報道，在今后研究中可通過分離辣椒骨中微生物，探討微生物與辣椒骨品質形成之間的關系，為辣椒骨加工奠定理論基礎。