脊髓損傷分子機制的生物信息學分析

2021-04-08 07:57:32劉冬

東南大學學報(醫學版) 2021年1期

劉冬

(東南大學附屬中大醫院，江蘇南京 210009)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)病因可為非創傷性，也可為創傷性。創傷性SCI為SCI的嚴重并發癥之一, 多由高處墜落、交通事故、體育運動意外等導致，患者損傷平面以下肢體發生嚴重功能障礙，對其身心造成極大的痛苦[1- 2]。手術解除壓迫、物理治療、急性期大量激素治療均是臨床使用較多的治療SCI的方法，目前研究較多的還有神經再生及神經保護療法，但均未取得較大突破[3- 4]。因此，闡明SCI的分子機制很有必要。

SCI包括兩種損傷機制，即原發性和繼發性損傷。原發性損傷(機械損傷、出血等)為不可逆損傷，多出現于損傷后4 h內。原發損傷引發復雜的繼發性損傷級聯反應，導致細胞進行性死亡、局部缺血及炎癥[5- 6]。由于繼發性損傷的可干預性，如何通過發生機制進行研究和給予有效的治療策略成為近些年來關注的熱點。隨著生物醫學的發展，高通量基因芯片技術等開始普及于疾病發生發展過程中分子變化的探索，這為SCI發病機制的研究提供了新方向。在最近的許多生物信息學研究中，分析了SCI后的不同時間點轉錄組[7- 8]，并對各種分子事件進行了表征，進一步說明了免疫應答、炎癥相關功能、脈管系統發育和神經系統功能在SCI的發展中發揮了作用[9- 11]。

在本研究中，利用GSE45006轉錄組數據集，分別評估損傷后3個時間點，即1 d、3 d和1周的差異表達基因(DEG)以進行通路和功能富集分析，構建蛋白質- 蛋白質相互作用(PPI)網絡，并通過軟件分析關鍵基因，以揭示可能與SCI相關的分子機制，同時為SCI的治療提供潛在靶標。

1 材料和方法

1.1 微陣列數據分析

NCBI- GEO為微陣列和基因表達譜的免費公共數據庫，從中獲得數據集GSE45006 SCI組和假手術組脊髓組織中的全基因組基因表達概況。測序平臺為GPL1355 ([Rat230_2] Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array)，使用動脈瘤夾沖擊壓縮損傷模型損傷大鼠胸脊髓(T7)，并分離受傷脊髓的震中區域組織，在基因芯片陣列上行后續檢測，其中包括4個假手術組和20個SCI組。

1.2 DEG數據處理

使用在線分析工具GEO2R 篩選DEG[12]。在本研究中，數據分為以下成對的組：在1、3 d和1、2、8周的假手術組和SCI組，通過P<0.05和|logFC|>2作為臨界點選擇DEG，然后在Draw Venn Diagram(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)輸入TXT格式的原始數據，在線比較DEG并構建Venn圖。

1.3 功能富集分析

利用DAVID(http：∥david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp)在線數據進行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 途徑分析[13], 同時利用WebGestalt(WEB- based GEne SeT AnaLysis Toolkit，http:∥www.webgestalt.org)在線數據庫進行GO (gene ontology)分析，從生物過程(biological process, BP)、細胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF) 3個方面注釋差異基因的功能, WebGestalt是目前進行DEG功能注釋的權威數據庫[14]。

1.4 PPI網絡和模塊分析

通過在線工具STRING(檢索相互作用基因的搜索工具)來評估PPI信息[15]。然后，使用Cytoscape[16]中的STRING應用程序檢查這些DEG之間的潛在相關性。此外，通過Cytoscape中的MCODE應用程序用于檢查PPI網絡的模塊預測關鍵基因。

2 結果

2.1 確定差異表達基因

通過GEO2R在線工具，數據歸一化，評估交叉可比性(圖1)，分析5個時間點的DEGs。與假手術組比較，在1、3 d和1、2、8周，SCI組分別有1 189、591、741、568、571個DEGs上調；966、294、537、438、432個DEGs下調(圖2)。DEGs數量變化波動結果表明基因表達改變發生在損傷后1、3 d和1周。用韋恩圖網站分別識別1 d、3 d和1周的DEGs，共監測到369種DEGs，包括SCI震中組織中的248個上調基因(logFC>0)和121個下調基因(logFC<0)(圖3和表1)。

2.2 功能富集分析

通過WebGestalt數據庫對全部369種DEGs進行分析，GO分析結果表明：(1) BP主要涉及生物調節、對刺激的反應、代謝過程、定位、發育過程等；(2) CC主要涉及細胞膜、細胞核、含蛋白質復合物、內膜系統、胞漿細胞等；(3) MF主要涉及蛋白質結合、離子結合、核苷酸結合、水解酶活性、核算結合等(圖4)。通過DAVID數據庫對全部369種DEGs進行分析，KEGG分析結果如表2所示。總體而言，本研究中DEGs主要與免疫和炎癥功能相關。

圖1 假手術組和SCI組基因表達的箱型圖數據標準化和交叉可比性

圖2 假手術組和SCI組在5個時間點之間的DEG數量

左：3個數據集中上調了248個DEGs(logFC>0)；右：3個數據集中下調了121個DEGs(logFC<0)

2.3 PPI和模塊分析

通過STRING在線數據庫輸入369個DEGs，分析構建PPI網絡，將得到的數據利用Cytoscape軟件進行更全面的生物信息學分析。利用MCODE插件進行模塊分析，得到20個中心節點(圖5)。

2.4 20個選定基因重新KEGG富集分析

為了了解這20 個DEGs可能涉及的通路途徑，再次使用DAVID數據庫對其進行了KEGG分析。結果顯示，5個基因(CCNA2、Cdk1、Mcm2、Mcm4、Mcm6)顯著富集于細胞周期途徑中(圖6)。

3 討論

動物SCI的實驗模型已被廣泛用于研究復雜的脊髓繼發性級聯損傷[17]。GSE45006數據集包括了SCI后1、3 d和1、2、8周5個時間點受傷脊髓的震中區域組織中以及假手術組脊髓組織中獲得的轉錄組數據。本研究采用生物信息學分析確定SCI中的分子事件和病理狀態。基于不同時間點的基因表達分析，確定3個時間點的共同DEGs，并進行KEGG和GO的富集分析。此外，構建PPI網絡和行模塊分析進一步了解SCI的分子過程，最后再把選中的基因進行KEGG分析。本研究中進行的分析可能有助于更好地理解SCI。

本研究KEGG和GO富集分析表明，1、3 d和1周3個時間點的共同DEGs主要與免疫反應及炎癥反應有關。炎癥是繼發性SCI過程的標志[18]。如前所述，SCI的嚴重程度與急性炎癥反應(其中包括促炎癥細胞因子和免疫細胞)強度之間存在關聯。促炎癥因子(IL- 1b、IL- 6和IL- 7)和抗炎癥細胞因子(IL- 4和IL- 10)的表達顯著增加，反映了受損組織的變性與存活之間的調控[18- 19]。一種保護性策略是針對炎癥過程并限制免疫細胞向損傷部位的浸潤[20- 21]。值得注意的是，另一組與炎癥相關的基因，包括Cd44、Cybb、Icam1、Cyba、Hck、Casp1、Tgfb1、Rac2、Itgb2和Cxcr4與促炎癥因子(IL- 1β、IL- 6和IL- 7)相比表現出不同的時間模式，表明受損部位存在復雜的炎癥性免疫微環境，需要進一步分析。這些發現確認了SCI后隨時間推移重復進行炎癥檢測的重要性[18]。

表1 脊髓損傷組3個時間點檢測到的所有369個DEGs(248個上調基因和121個下調基因)

細胞周期蛋白A2(CCNA2)是一種在G1期積累的細胞周期蛋白，在G1/S和G2/M的過渡時期起調節作用[22]。有研究[23]表明，在SCI早期急性期的生物信息學分析中，PPI網絡中顯示CCNA2是排名前10位的核心基因。SCI引起與認知及情感變化相關的腦部炎癥，這可能與M1型小膠質細胞的延遲持續誘導及相關的細胞周期活化有關，從而導致認知缺陷和生理性抑郁[24]。

SCI可以誘導細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)活性增加，包括CDK1，并增加細胞周期蛋白B1(CCNB1，是CDK1的主要激活因子)的水平，此外在體外實驗或者大鼠SCI模型中抑制E2F1/CDK1信號通路具有神經保護功能[25]。

微染色體維持復合物(MCM)在確定細胞復制潛力中起著至關重要的作用，而且在細胞對DNA損傷的反應中也起著至關重要的作用。事實上，MCM蛋白不僅與S期檢查點調節器相互作用，還與DNA修復途徑有關[26- 27]。MCM2基因在大鼠SCI中起到關鍵作用[28]。

有不少研究證明CCNA2、cdKI、Mcm2、Mcm4、Mcm6這5個基因可能與SCI的預后有關，但從PubMed網站上搜索這5個基因來看，關于SCI的報道很少，因此本研究數據可以為SCI的進一步研究提供有用的信息和方向。

本研究的局限性在于原始數據不包括損傷后6個月的慢性期，也不包括非常急性期(SCI后0.5、4 h)的基因表達數據以及KEGG和GO富集分析數據，這限制了SCI發展過程中有關分子過程的信息。同時，SCI組所取組織僅僅為損傷震中區域的組織，如果通過獲得其他位置組織的轉錄數據進行全面分析，可能會進一步揭示病理生理過程中發生的復雜變化。