生長(zhǎng)抑素受體2在小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與患者生物學(xué)特征的關(guān)系

徐文玲，李彥楠，朱曉莉

(東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210009)

小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)在肺癌中占15%[1- 4]，但其惡性程度高，較早發(fā)生轉(zhuǎn)移，易耐藥復(fù)發(fā)。SCLC含有神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒，又被劃分為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine tumor，NET)。生長(zhǎng)抑素(somatostatin, SST)作為神經(jīng)肽類激素在人體內(nèi)廣泛分布，主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌腺，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。近年來(lái)的研究主要集中于SST及其類似物(somatostatin analog, SSTA)的抗腫瘤作用。其抗腫瘤作用不僅表現(xiàn)在能抑制絕大多數(shù)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，而且對(duì)普通實(shí)體瘤也同樣具有抑制作用，這對(duì)腫瘤的診斷和治療有著重要作用。SST的生物學(xué)活性是由靶細(xì)胞上的生長(zhǎng)抑素受體(somatostatin receptor，SSTR)介導(dǎo)發(fā)揮的，即通過(guò)與細(xì)胞膜上相應(yīng)的特異性受體相結(jié)合，發(fā)揮多種生物學(xué)功能[5- 7]。80%～90%的肺NET都表達(dá)SSTR，主要是SSTR2，分化好的肺NET比未分化的肺NET SSTR2表達(dá)密度高[8- 9]。目前針對(duì)SSTR的放射性核素標(biāo)記的生長(zhǎng)抑素類似物標(biāo)靶放射治療腫瘤成為研究的熱點(diǎn)[10- 12]，但關(guān)于SSTR2的表達(dá)高低與SCLC患者的臨床病理特征，包括性別、年齡、既往吸煙史、TNM分期之間的相關(guān)性研究甚少。為此，本研究通過(guò)體外檢測(cè)SSTR2在SCLC細(xì)胞及組織中的表達(dá)情況，并對(duì)SCLC患者的生物學(xué)特征(年齡、性別、吸煙、TNM分期、預(yù)后)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，判定SSTR2的表達(dá)與患者生物學(xué)特征是否具有相關(guān)性，評(píng)估能否將SSTR2作為診斷、治療的靶點(diǎn)，從而拓寬SCLC的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2008年5月至2015年9月入住東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，病理明確診斷為SCLC的初診、未治，且有足夠病理標(biāo)本，根據(jù)美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評(píng)分≤2，至少完成2個(gè)周期化療，并有完整臨床資料的患者。排除標(biāo)準(zhǔn):有嚴(yán)重心肺疾病、肝腎功能障礙者不能耐受化療的患者;合并內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及其他部位惡性腫瘤者;PS評(píng)分>2分的患者;病理組織不充足、不能行免疫組化檢測(cè)的患者。最終收集到經(jīng)病理證實(shí)的SCLC石蠟標(biāo)本46例。以電話方式隨訪患者，隨訪截至2016年3月。所有入選病例入組前均未接受放化療、免疫或生物治療等任何抗腫瘤治療。所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)10%福爾馬林固定, 石蠟包埋。其中男38例，女8例；年齡42～83歲；吸煙35例，不吸煙11例；按2009年UICC(國(guó)際抗癌聯(lián)盟)修訂的肺癌TNM病理分期標(biāo)準(zhǔn)1B期1例，2A期1例，2B期1例，3A期2例，3B期12例，4期29例。另取非腫瘤肺組織10例做對(duì)照分析。其中男8例，女2例；年齡45～80歲；氣管鏡下正常組織3例，炎性組織7例。

人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI- H446購(gòu)買(mǎi)自武漢博士德生物工程有限公司；上皮細(xì)胞HEK- 293由中大醫(yī)院腫瘤科實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)用兔抗人單克隆抗體SSTR2購(gòu)自南京泉暉醫(yī)療器械公司，工作液濃度為1∶100。通用型SP免疫組化試劑盒、DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定參考文獻(xiàn)[13]，SSTR2以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性。先在低倍鏡下觀察大體著色情況，再在高倍鏡下(×200)下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞的比例進(jìn)行分級(jí)：陰性(-)為無(wú)棕色染色或染色陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)<5%；弱陽(yáng)性(+)為陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)5%～24%；中度陽(yáng)性(++)為陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)25%～49%；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)≥50%。為便于統(tǒng)計(jì)，將+～+++統(tǒng)歸為陽(yáng)性表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本試驗(yàn)所有資料經(jīng)Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Spearman相關(guān)分析法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，Kaplan- Meier法進(jìn)行生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SSTR2的表達(dá)

SSTR2在SCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)率為69.6% (32/46)，其中強(qiáng)陽(yáng)性(圖1A)表達(dá)率為34.8%(16/46)，中度陽(yáng)性(圖1B)表達(dá)率為23.9%(11/46)，弱陽(yáng)性(圖1C)表達(dá)率為10.9%(5/46)。SCLC中SSTR2陰性表達(dá)見(jiàn)圖1D。SSTR2在非腫瘤肺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為10%(1/10)。SSTR2在非腫瘤肺組織中陰性表達(dá)見(jiàn)圖2。

圖1 SSTR2在SCLC組織中表達(dá)率(×400)

人小細(xì)胞肺癌株NCI- H446中，SSTR2呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(+++)，呈棕色染色，主要表達(dá)于細(xì)胞膜(圖3A)。上皮細(xì)胞HEK- 293中，SSTR2無(wú)表達(dá)(圖3B)。

2.2 SSTR2的表達(dá)及其與生物學(xué)特性的相關(guān)性

2.2.1 SSTR2與患者臨床病理特征 根據(jù)Spearman相關(guān)分析法分析，SSTR2表達(dá)與患者年齡、性別、既往吸煙史、TNM分期均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表1。

圖2 SSTR2在非腫瘤肺組織中陰性表達(dá)(×200)

2.2.2 SSTR2的表達(dá)與生存期 SSTR2表達(dá)陰性者平均生存期為28.4個(gè)月，中位生存期為24個(gè)月。SSTR2表達(dá)陽(yáng)性者平均生存期為33.9個(gè)月，中位生存期為21個(gè)月。由生存曲線可看出SSTR2表達(dá)陰性組與表達(dá)陽(yáng)性組的曲線差異并不顯著(χ2=0.022，P=0.883)，說(shuō)明SCLC中SSTR2的表達(dá)與患者的生存期無(wú)明顯相關(guān)。見(jiàn)圖4。

3 討 論

SCLC惡性程度高，轉(zhuǎn)移早，易耐藥、復(fù)發(fā)。SCLC屬于神經(jīng)內(nèi)分泌源性腫瘤。SSTR2在NET表面高表達(dá)，已成為SSTA靶向藥物治療的作用靶點(diǎn)。目前關(guān)于SSTR2的表達(dá)高低與SCLC患者臨床病理特征，包括性別、年齡、既往吸煙史、TNM分期之間的相關(guān)性研究甚少。本研究結(jié)果顯示，SSTR2在SCLC細(xì)胞株NCI- H446中存在強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Erlanolsson等[14]認(rèn)為，所有SCLC細(xì)胞株中有80%～100%表達(dá)SSTR2。Lewin等[10]發(fā)現(xiàn)，在SCLC細(xì)胞株NCI- H69中SSTR2有大量表達(dá)。本研究結(jié)果與其基本一致。目前關(guān)于SSTR2在肺癌組織中表達(dá)的報(bào)道有限。王秀問(wèn)[15]運(yùn)用免疫組化方式檢測(cè)了118例NSCLC石蠟標(biāo)本中SSTR2的陽(yáng)性表達(dá)率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSTR2在NSCLC組織的陽(yáng)性表達(dá)率為62.7%，SSTR2主要定位于細(xì)胞膜上，少量細(xì)胞漿染色。Kaemmerer等[16]收集了34例SCLC患者，運(yùn)用RT- PCR檢測(cè)出SSTR2A的陽(yáng)性表達(dá)率為45%。汪靜等使用原位雜交技術(shù)檢測(cè)了6例SCLC患者的手術(shù)標(biāo)本中SSTR2的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5例患者SSTR2呈陽(yáng)性。本研究SSTR2在SCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)率為69.6%。多個(gè)研究中患者組織中SSTR2的表達(dá)水平出現(xiàn)差異主要與檢測(cè)樣本量和檢測(cè)方法有關(guān)。目前檢測(cè)SSTR2表達(dá)的方法主要有受體閃爍掃描法、原位雜交法、RT- PCR法和免疫組化法。Righi等[17]認(rèn)為，免疫組化檢測(cè)法的敏感性低于受體閃爍掃描法。

A. NCI- H446中SSTR2表達(dá)；B．上皮細(xì)胞HEK- 293中SSTR2表達(dá)

目前關(guān)于SSTR2的表達(dá)率高低與惡性腫瘤患者臨床病理特征(包括性別、年齡、既往吸煙史、TNM分期)之間的相關(guān)性研究不多。王少華等[18]采用免疫組化方法對(duì)82例原發(fā)性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者檢測(cè)SSTR的表達(dá)，分析這些患者腫瘤組織SSTR、病理分期及分化程度與生存的關(guān)系，結(jié)果為90%以上乳腺癌細(xì)胞表達(dá)SSTR；陽(yáng)性染色表現(xiàn)為棕紅色彌漫分布，呈風(fēng)塵狀和顆粒狀，間質(zhì)細(xì)胞亦有少量弱陽(yáng)性或中度陽(yáng)性表達(dá)；原發(fā)性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織SSTR的表達(dá)與腫瘤病理分化程度及病理分期顯著相關(guān)，即腫瘤分化越好SSTR陽(yáng)性表達(dá)程度越強(qiáng)，病理分期越晚SSTR陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度越弱。劉衛(wèi)兵等[19]對(duì)41例大腸癌組織中的SSTR1- 3亞型蛋白陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，SSTR2和SSTR3亞型蛋白與腫瘤的發(fā)生部位及分化程度均無(wú)明顯相關(guān)。王秀問(wèn)[15]探討了NSCLC患者SSTR2的表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示SSTR2的表達(dá)與患者年齡、性別、既往吸煙史、腫瘤組織類型、腫瘤的大小、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均不相關(guān)，但與腫瘤TNM分期相關(guān)，SSTR2的表達(dá)率隨分期增高呈下降趨勢(shì)。然而未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道SSTR2與SCLC患者臨床病理特征包括性別、年齡、既往吸煙史、TNM分期之間相關(guān)性。本研究SSTR2的表達(dá)與腫瘤TNM分期間無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.485)，可能原因：(1) SCLC的生物學(xué)特性與非小細(xì)胞肺癌的生物學(xué)特性存在明顯差異；(2) 樣本量較少，存在偏倚。

表1 SSTR2與患者臨床病理特征關(guān)系例

圖4 SCLC患者SSTR2表達(dá)陽(yáng)性組與表達(dá)陰性組Kaplan- Meier生存曲線

目前關(guān)于SSTR2的表達(dá)與惡性腫瘤預(yù)后的相關(guān)性研究甚少。一項(xiàng)對(duì)原發(fā)性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌SSTR表達(dá)與預(yù)后關(guān)系研究結(jié)果[20]顯示：SSTR的表達(dá)強(qiáng)度與患者的五年生存率呈顯著正相關(guān)，即腫瘤組織中SSTR的表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)，患者的5年生存率越高，預(yù)后越好，反之，5年生存率越低，預(yù)后越差。國(guó)外研究者[21]對(duì)乳腺癌細(xì)胞R3- MCF- 7中SSTR3的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制作了探討，發(fā)現(xiàn)SSTR3的過(guò)表達(dá)可以上調(diào)p27kip1基因表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯；還能上調(diào)PTP- 1C表達(dá)，使PARP- 1的表達(dá)增加，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。故乳腺癌細(xì)胞中SSTR3的表達(dá)越高，腫瘤細(xì)胞凋亡越快，患者預(yù)后越好。而關(guān)于SSTR2的表達(dá)與肺癌的預(yù)后鮮見(jiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)[15]對(duì)NSCLC中SSTR2的表達(dá)與預(yù)后之間關(guān)系的研究顯示：SSTR2表達(dá)陰性組生存曲線明顯低于陽(yáng)性組，即SSTR2表達(dá)率越高，生存期越長(zhǎng)。這可能與SSTR2的高表達(dá)與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)[20]，可能的機(jī)制是SSTR能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，例如促分裂原活化激酶(mitogen- activatedproteinkinase,MAPK)途徑，其參與細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]，激活絡(luò)氨酸磷酸酶和使激活的生長(zhǎng)因子受體磷酸化從而產(chǎn)生有絲分裂信號(hào)，起抗細(xì)胞增殖作用[23]。目前關(guān)于SSTR的表達(dá)與SCLC預(yù)后的相關(guān)性研究甚少。Lapa 等[24]通過(guò)21例SCLC患者研究SSTR的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，得出SSTR的表達(dá)與晚期SCLC患者的生存期無(wú)關(guān)，不能作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的指標(biāo)。關(guān)于SSTR2的表達(dá)與SCLC患者預(yù)后的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究SSTR2表達(dá)陽(yáng)性者平均生存期為33.9個(gè)月，中位生存期為21個(gè)月；SSTR2表達(dá)陰性者平均生存期為28.4個(gè)月，中位生存期為24個(gè)月。兩組生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.883)。這可能的原因?yàn)椋?1) 研究樣本量較少，且隨訪患者預(yù)后時(shí)，部分出現(xiàn)失訪，失訪率為21.7%(10/46)，可能導(dǎo)致結(jié)果的偏倚；(2) 患者的后續(xù)治療存在差異。若要得到更準(zhǔn)確的結(jié)論，須進(jìn)行多中心隨機(jī)、雙盲、對(duì)照研究。

總之，作為NET之一的SCLC，不論在腫瘤組織標(biāo)本還是腫瘤細(xì)胞株中，SSTR2表達(dá)率較高，組織中中度陽(yáng)性以上表達(dá)率達(dá)58.7%，而在非腫瘤肺組織及上皮對(duì)照細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。SSTR2可作為SCLC靶向診斷和治療的穩(wěn)定靶點(diǎn)。SSTR2在SCLC中的表達(dá)與患者年齡、性別、是否吸煙、TNM分期及生存期不相關(guān)，其可能不能作為判斷SCLC患者預(yù)后的指標(biāo)。