沉默JMJD2B通過誘導DNA損傷抑制人胃癌細胞的惡性表型

陳麗莎，徐永成，曾書君，陳惠新

(中山大學附屬惠州市中心人民醫院 消化內科，廣東 惠州 516000)

近年來涌現了大量的關于表觀遺傳修飾、DNA損傷反應、腫瘤發生發展三者之間關系的研究，其中包括是否可通過調節組蛋白甲基化修飾狀態改變腫瘤細胞對DNA損傷的反應，從而降低腫瘤的耐藥性。磷酸化H2AX(serine 139，γH2AX)是反映DNA損傷的重要指標，為細胞發生最嚴重的DNA損傷—DNA雙鏈斷裂(DNA double- strand break, DSB)的標志[1]。對結腸癌的研究[2]顯示，含Jumonji結構域的蛋白2B(Jumonji domain- containing protein 2B, JMJD2B)可通過STAT3信號通路調節DNA損傷反應，但JMJD2B在胃癌中是否也可通過調節DNA損傷反應影響腫瘤的發生發展，尚無相關研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞株MGC803、SGC7901來自惠州市中心人民醫院消化實驗室。胎牛血清及RPMI- 1640培養基購自美國Gibco公司。JMJD2B siRNA、陰性對照siRNA(與任何靶基因無序列同源性)購自上海吉瑪公司。一抗：兔抗JMJD2B單克隆抗體(美國Bethyl Laboratories公司)、兔抗phorsphor- H2AX(Ser 139)多克隆抗體(美國Millipore公司)、兔抗α- tubulin抗體(內參照，美國Cell Signaling Technology公司)；二抗：山羊抗兔 HRP(上?？党晒?。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 對MGC803、SGC7901細胞使用含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養基培養，并置于恒溫37 ℃、體積分數5% CO2的培養箱，95%濕度條件下進行培養。

1.2.2 siRNA轉染 取對數生長期細胞種植于6孔板中，按細胞2×105孔-1進行接種，24 h后待細胞生長至密度約50%時，將JMJD2B siRNA或陰性對照siRNA使用轉染試劑Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)轉染，48 h后收集細胞或進行后續實驗。

1.2.3 彗星實驗 采用0.25%胰蛋白酶消化對數生長期細胞，以1 000 r·min-1離心10 min，PBS調整細胞濃度為5×104ml-1。使用彗星實驗試劑盒(Comet assay,北京博樂通生物科技有限公司)，取100 μl 0.5%正常熔點瓊脂糖鋪于磨砂載玻片上，蓋上蓋玻片，置于冰上固化5～10 min；移去蓋玻片，在第一層膠上鋪上100 μl 0.5%低熔點瓊脂糖與10 μl細胞懸液(約500個細胞)的混合液，蓋上蓋玻片，置于冰上固化5～10 min；移去蓋玻片，細胞裂解2.5 h，電泳緩沖液中放置20 min使DNA解鏈，電泳25 min，中和，DAPI 染色，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.2.4 Western blotting 細胞轉染JMJD2B siRNA或陰性對照siRNA 48 h后，以0.25%胰蛋白酶消化收集，離心抽提蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行蛋白定量。取50 μg蛋白，進行SDS- PAGE電泳分離，穩壓冰浴電轉至NC膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜、二抗孵育1 h，常規ECL曝光，掃描蛋白條帶，進行灰度分析。

1.2.5 Cell Counting Kit- 8(CCK- 8)實驗 于96孔板中按5×103孔-1接種對數生長期的MGC803、SGC7901細胞，每孔200 μl，24 h 后待細胞生長至密度約50%時轉染siRNA，分別于48、72 h后收集細胞進行CCK- 8實驗。設不含細胞、只含培養基的空白組、陰性對照siRNA組和JMJD2B siRNA組，每組設3個復孔。按照CCK- 8試劑盒(日本同仁化學研究所)說明書操作，以酶標儀讀取各孔450 nm波長處吸光度值(A值)。

1.2.6 細胞周期分析 培養MGC803、SGC7901細胞24 h至對數生長期，按陰性對照組、實驗組分別轉染siRNA 48 h，每組設3個復孔。用0.25%胰蛋白酶消化、收集細胞，預冷體積分數70%乙醇4 ℃固定過夜，PBS洗滌，加入100 U·ml-1RNA酶A(D202，TaKaRa公司)1 ml，37 ℃水浴30 min，加入含Triton X- 100(上海碧云天生物技術有限公司)的50 g·ml-1碘化丙啶染液(propidium iodide，PI，上海碧云天生物技術有限公司)0.5 ml，4 ℃避光30 min，進行流式細胞儀檢測。

1.2.7 細胞凋亡分析 培養MGC803、SGC7901細胞24 h至對數生長期，按陰性對照組、實驗組分別轉染siRNA 48 h，每組設3個復孔。按照Annexin V Apoptosis Detection Kit I(美國BD Pharmingen公司)說明書操作，進行流式細胞儀檢測。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 沉默人胃癌細胞JMJD2B的表達誘導細胞發生DNA損傷反應

人胃癌細胞株MGC803、SGC7901于相同條件下培養，并分別給予陰性對照siRNA、JMJD2B siRNA的處理，采用Western blotting檢測DNA損傷特異性標志物γH2AX的表達，同時應用彗星實驗檢測DNA損傷情況，結果均顯示沉默JMJD2B表達的人胃癌細胞發生DNA損傷(圖1)。

圖1 沉默人胃癌細胞JMJD2B的表達誘導細胞發生DNA損傷反應

2.2 沉默人胃癌細胞JMJD2B的表達對增殖的影響

對轉染JMJD2B siRNA的MGC803、SGC7901細胞行CCK- 8實驗的結果顯示，實驗組相對存活率低于陰性對照組(圖2)，說明沉默JMJD2B表達的人胃癌細胞的增殖明顯受到抑制。

圖2 沉默人胃癌細胞JMJD2B的表達對細胞增殖的影響

2.3 沉默人胃癌細胞JMJD2B的表達對細胞周期分布的影響

對轉染JMJD2B siRNA的MGC803、SGC7901細胞分別行流式細胞儀分析的結果顯示，MGC803細胞發生G0/G1期細胞周期阻滯，而SGC7901細胞發生G2/M期細胞周期阻滯(圖3)，說明沉默JMJD2B表達誘導了細胞周期阻滯的發生，從而抑制細胞的增殖。

圖3 沉默人胃癌細胞JMJD2B的表達對細胞周期的影響

2.4 沉默人胃癌細胞JMJD2B的表達對凋亡的影響

對轉染JMJD2B siRNA的MGC803、SGC7901細胞行流式細胞儀分析的結果顯示，凋亡細胞比例明顯上升(圖4)，說明沉默JMJD2B的表達誘導了細胞發生凋亡，從而抑制細胞的增殖。

圖4 沉默人胃癌細胞JMJD2B的表達對細胞凋亡的影響

3 討 論

組蛋白甲基化修飾以及DNA損傷反應在腫瘤發生發展中的作用早有研究，近年來關于兩者之間的相互關系在腫瘤中的研究[3- 4]越來越多。本研究結果顯示，沉默人胃癌細胞組蛋白去甲基化酶JMJD2B的表達可誘導DNA損傷反應的發生(圖1)。在腫瘤早期，人體細胞通過誘導DNA損傷反應來抑制腫瘤的發生發展，而DNA損傷反應則通過激活信號通路來維持基因組的穩定性，其中包括：(1) 由DNA損傷修復蛋白介導細胞進行DNA損傷修復，細胞發生周期阻滯；(2) 更嚴重的DNA損傷會進入p53介導的細胞凋亡途徑[5]。人胃癌細胞發生DNA損傷反應后，導致細胞周期阻滯、細胞凋亡的細胞比例增加(圖3、4)。然而，在腫瘤細胞中改變組蛋白甲基化修飾狀態誘導DNA損傷的具體機制尚未闡明。

組蛋白甲基化修飾在DNA損傷反應的很多環節發揮重要作用，包括解開高度有序的染色質結構、啟動細胞信號級聯反應、募集蛋白質至DSB位點以及促進DNA斷裂修復過程等。細胞發生DSB時，組蛋白翻譯后修飾在誘導及調節細胞對損傷的反應中至關重要。沉默組蛋白甲基轉移酶EZH2的表達可激活細胞發生DNA損傷反應[6]，組蛋白甲基轉移酶SET7和去甲基化酶LSD1均可通過調節UHRF1的甲基化水平在DSB修復中發揮重要作用[7]。H3K9me3去甲基化酶JMJD2D和JMJD2A通過下調H3K9me3的甲基化水平，抑制了Tip60激活ATM介導的DNA損傷反應，磷酸化ATM下調，其介導的p53和chk2磷酸化受抑制，DNA損傷反應異常，誘導細胞發生轉化甚至癌變。抑制組蛋白去甲基化酶PHF2的表達可上調DNA復制相關基因啟動子上H3K9me3的水平，誘導細胞發生DNA損傷[8- 9]。抑制JMJD2B可誘導DNA損傷反應介導的p21和PIG3的表達，同樣，細胞發生DNA損傷后，JMJD2B作為p53的靶基因在調節DNA損傷反應中亦發揮重要作用[10]。

然而，組蛋白甲基化在DNA損傷反應及修復過程發揮作用的機制尚不十分清晰。細胞在受到電離輻射后會發生DNA損傷，通過抑制組蛋白去甲基化酶KDM2B的活性，組蛋白H3賴氨酸36二甲基化水平增加，DSB位點上含Ku70的DNA- PK募集增加，DNA損傷修復途徑NHEJ被激活，發生放療抵抗，細胞存活率提高[11]。接受電離輻射的細胞通過抑制JMJD2B或甲基轉移酶SUV39H1的表達可延緩結構性異染色質DNA修復的進程，進而降低細胞存活率[12]。臨床上，腦膠質瘤易復發，同時放化療抵抗率高，而使用H3K9甲基轉移酶G9a特異性抑制劑BIX- 01294可提高膠質瘤細胞的放療敏感性，其機制包括抑制DSB的修復[13]，促進腫瘤細胞死亡。目前使用的很多化療藥屬于DNA損傷藥物。Mar等[14]報道，組蛋白甲基轉移酶SETD2突變可通過影響細胞對DNA損傷的識別，誘導細胞對DNA損傷藥物的耐藥性。組蛋白甲基轉移酶MMSET調節H4K20甲基化水平，有利于53BP1募集至DSB位點[15]；同樣，抑制H3K79甲基轉移酶DOT1L的表達，也抑制了53BP1募集至DSBs位點[16- 17]，細胞發生DNA損傷，利用該特點在結直腸癌細胞中使用siRNA或小分子抑制劑抑制DOT1L的表達可通過調節DNA損傷修復途徑，提高腫瘤細胞對化療藥的敏感性[18]。

JMJD2B是抗腫瘤藥物作用的重要靶點[19]。在耐順鉑的人非小細胞肺癌[20]細胞中，JMJD2家族，特別是JMJD2B的表達明顯上調，而使用JMJD2家族蛋白的特異性抑制劑可增加癌細胞對順鉑的反應[21]。本研究結果顯示，抑制JMJD2B可誘導人胃癌細胞發生DNA損傷，抑制癌細胞的惡性表型。因此，進一步深入研究JMJD2B與DNA損傷反應之間的關系和機制，有望可減少腫瘤的放化療抵抗性。