母體循環(huán)血清TLR- 1、2、4、6水平與胎膜早破及亞臨床絨毛膜羊膜炎關(guān)系的研究

朱林鳳，王久陽(yáng)，惠玉潔，王碩

(北京市平谷區(qū)醫(yī)院 1.婦產(chǎn)科， 2.病理科，北京 101200)

胎膜早破(premature rupture of the membranes，PROM)在臨床上的發(fā)生率較高[1]，其確切機(jī)制尚不明確，但是慢性感染和炎癥是目前已知的引起自發(fā)性早產(chǎn)的主要原因[2]。絨毛膜羊膜炎是影響母嬰結(jié)局最重要的危險(xiǎn)因素之一，多數(shù)孕產(chǎn)婦由于并沒有表現(xiàn)出任何臨床癥狀，屬于亞臨床絨毛膜羊膜炎，因此在臨床上難以確診[3]。Toll樣受體(Toll- like receptor，TLR)屬于重要的先天性免疫模式識(shí)別受體(innate immune pattern recognition receptor，PRR)，在介導(dǎo)感染所致的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[4]。目前已經(jīng)鑒定出10種人類TLR基因編碼蛋白，每個(gè)基因都能感知不同的感染產(chǎn)物；同樣地，不同病原體可能通過特異性TLR介導(dǎo)的信號(hào)機(jī)制引起特異性反應(yīng)[5]。而絨毛膜羊膜也可以通過TLR對(duì)病原微生物進(jìn)行感知和反應(yīng)，但是對(duì)其研究甚少。因此，本研究旨在通過分析母體循環(huán)血中TLR- 1、TLR- 2、TLR- 4、TLR- 6水平是否與胎膜組織中的基因改變有關(guān)，以及與PROM、亞臨床絨毛膜羊膜炎的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究是一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究，于2019年1月至12月在本院婦產(chǎn)科進(jìn)行。選取520例PROM孕婦(PROM組)，包括足月(≥370/7孕周)PROM(term premature rupture of the membranes，tPROM)249例[平均年齡(29.76±4.30)歲]和未足月(<370/7孕周)PROM(preterm premature rupture of the membranes，pPROM)271例[平均年齡(30.38±4.75)歲]，即tPROM組和pPROM組。同時(shí)選取在本院同時(shí)期進(jìn)行孕檢和分娩的50例足月正常孕婦[平均年齡(29.41±7.80)歲]及50例未足月正常孕婦[平均年齡(30.22±4.38)歲]為對(duì)照組，正常孕產(chǎn)婦經(jīng)胎膜病理檢查排除絨毛膜羊膜炎。所有孕產(chǎn)婦入院后接受產(chǎn)前護(hù)理，在對(duì)研究的充分解釋后，自愿簽署書面同意書(由本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)提供)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) PROM 是通過臨床檢查、羊水外流到陰道、陰道pH值測(cè)試、超聲檢查來確定的，符合《婦產(chǎn)科學(xué)》(第8版)[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2) PROM 時(shí)間<18 h，且在破膜>18 h時(shí)注射抗生素預(yù)防感染；(3) 單胎妊娠；(4) 無典型的臨床絨毛膜羊膜炎癥狀(發(fā)熱、母體或胎兒心動(dòng)過速、子宮壓痛、陰道分泌物有異味)。排除標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病、高血壓、全身性疾病或嚴(yán)重全身感染史者；多胎妊娠、胎兒畸形、前置胎盤、機(jī)械性損傷等者。另外，根據(jù)胎盤胎膜組織病理檢查提示絨毛膜及羊膜組織炎癥細(xì)胞>5個(gè)/HP定義為亞臨床絨毛膜羊膜炎[7]。

1.2 組織標(biāo)本獲取及處理

分娩后15 min內(nèi)在無菌條件下從胎盤中央部分剝離胎膜。用生理鹽水和無菌棉紗布從膜上除去蛻膜和黏附的印跡凝塊。將這些組織置于含有青霉素/鏈霉素(10 μl·ml-1)和兩性霉素B(1 μl·ml-1)的Hanks平衡鹽溶液中。每個(gè)患者取1個(gè)胎膜樣本，用光鏡檢查(石蠟包埋切片，分別進(jìn)行HE染色和免疫組化染色)。另外取2片致密絨毛組織(約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，以避免鈣化壞死區(qū))，用DEPC水清洗后放入液氮中10 min，然后-80 ℃保存，進(jìn)行組織總RNA提取。另外采集孕婦入院時(shí)、分娩前且使用抗生素前的血液樣本5 ml，分離血清樣本，-80 ℃保存直至用于檢測(cè)血清TLR- 1、TLR- 2、TLR- 4、TLR- 6水平。

1.3 血清TLR- 1、TLR- 2、TLR- 4、TLR- 6檢測(cè)

使用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟簡(jiǎn)述如下：將未稀釋的血清樣本和對(duì)照品加入分別涂有抗TLR抗體的孔中，在37 ℃下培養(yǎng)2 h，加入100 μl鏈霉親和素-辣根過氧化物酶在37 ℃下持續(xù)30 min，加入顯色試劑。在450、620 nm波長(zhǎng)下，使用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液吸光度值。根據(jù)對(duì)照品擬定一個(gè)線性回歸校準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出血清TLR- 1、TLR- 2、TLR- 4、TLR- 6質(zhì)量濃度。

1.4 胎膜組織總RNA提取和qRT- PCR檢測(cè)

使用Illustra RNAspin微型分離試劑盒(美國(guó)GE Healthcare公司)從胎膜組織中提取總RNA。采用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的吸光度比值(260 nm/280 nm)，以確定總RNA的質(zhì)量和濃度。使用cDNA Archive試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)對(duì)RNA(0.1 mg·ml-1)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法定量分析TLR的mRNA表達(dá)。PCR條件：95 ℃變性10 min，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s進(jìn)行40次熱循環(huán)。所有反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行3次，每次運(yùn)行中包括陰性對(duì)照。每個(gè)樣本中TLR的表達(dá)水平用GAPDH內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以無絨毛膜羊膜炎的足月妊娠的平均CT值作為校正值，采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5 免疫組化檢測(cè)及結(jié)果判斷

每組隨機(jī)取5例孕婦組織進(jìn)行免疫組化染色分析TLR- 1、TLR- 2、TLR- 4、TLR- 6蛋白表達(dá)定位。將組織切片脫蠟水化，滴加檸檬酸鹽緩沖液，煮沸30 min進(jìn)行抗原熱修復(fù)。PSB清洗后，用H2O2在室溫下使內(nèi)源性過氧化物酶活性猝滅10 min。分別用多克隆兔抗TLR- 2(1∶400稀釋，美國(guó)Abcam公司)、TLR- 4(1∶800稀釋，美國(guó)Abcam公司)抗體在室溫下孵育3 h,用二抗孵育1 h。3,30- 二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物(DAB)對(duì)其進(jìn)行可視化。蘇木精復(fù)染。陰性對(duì)照組省略原抗體，用PBS替代。由兩名獨(dú)立的觀察者在奧林巴斯BX41顯微鏡下對(duì)至少10個(gè)放大倍數(shù)為200的顯微鏡場(chǎng)下進(jìn)行觀察，細(xì)胞呈明顯的棕色染色則視為陽(yáng)性染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 4組孕婦和新生兒基礎(chǔ)資料比較

兩組PROM與相應(yīng)的對(duì)照組(足月對(duì)照組和未足月對(duì)照組)相比，年齡、孕齡、孕次、產(chǎn)次、剖宮產(chǎn)率和新生兒體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；另外tPROM組和pPROM組新生兒1 min、5 min Apgar評(píng)分分別低于足月對(duì)照組和未足月對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 4組孕婦血清TLR- 1、TLR- 2、TLR- 4、TLR- 6水平比較

與相應(yīng)的足月對(duì)照組和未足月對(duì)照組相比，tPROM組和pPROM組孕婦血清TLR- 2、TLR- 4水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而血清TLR- 1、TLR- 6水平差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 4組孕婦和新生兒基礎(chǔ)臨床資料比較

表2 4組孕婦血清TLR- 1、TLR- 2、TLR- 4、TLR- 6水平比較ng·L-1Tab 2 The levels of serum TLR- 1, TLR- 2, TLR- 4, TLR- 6 of pregnant women in 4 groupsng·L-1

2.3 4組孕婦胎膜組織TLR- 1 mRNA、TLR- 2 mRNA、TLR- 4 mRNA、TLR- 6 mRNA相對(duì)表達(dá)量

與相應(yīng)的足月對(duì)照組和未足月對(duì)照組相比，tPROM組和pPROM組孕婦胎膜組織TLR- 2 mRNA、TLR- 4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而胎膜組織TLR- 1 mRNA、TLR- 6 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。經(jīng)Pearson法分析，PROM孕婦血清TLR- 1、TLR- 2、TLR- 4、TLR- 6水平與胎膜組織中TLR- 1 mRNA、TLR- 2 mRNA、TLR- 4 mRNA、TLR- 6 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)，r值分別為0.654、0.817、0.825、0.579，均P<0.001。

2.4 4組孕婦胎膜組織TLR- 2、TLR- 4蛋白表達(dá)定位

經(jīng)免疫組化分析，TLR- 2、TLR- 4蛋白主要表達(dá)于羊膜上皮細(xì)胞(amniotic epithelium,ae)、絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞(cytotrophoblast layer,ct)和蛻膜細(xì)胞(decidua,dec)。結(jié)締組織(connective tissue layer,cl)中TLR- 2蛋白和TLR- 4蛋白陰性表達(dá)或弱表達(dá)。見圖1。

表3 4組孕婦胎膜組織中TLR- 1 mRNA、TLR- 2 mRNA、TLR- 4 mRNA、TLR- 6 mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.5 PROM合并亞臨床絨毛膜羊膜炎孕婦血清TLR- 1、TLR- 2、TLR- 4、TLR- 6水平變化

根據(jù)組織病理學(xué)診斷，tPROM組和pPROM組分別有53例(21.29%)和116例(42.80%)孕婦合并亞臨床絨毛膜羊膜炎。與未合并亞臨床絨毛膜羊膜炎孕婦相比，tPROM組和pPROM組中合并亞臨床絨毛膜羊膜炎的孕婦血清TLR- 2、TLR- 4水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但是血清TLR- 1、TLR- 6水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

ae.羊膜上皮細(xì)胞；ct.絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞；dec.蛻膜細(xì)胞；cl.結(jié)締組織

2.6 多因素Logistic回歸分析血清TLR- 2、TLR- 4與亞臨床絨毛膜羊膜炎發(fā)生的關(guān)系

多因素Logistic回歸分析顯示，在校正了年齡、孕齡、孕次、產(chǎn)次、剖宮產(chǎn)率、新生兒體質(zhì)量、血清TLR- 1和TLR- 6等混雜因素后，血清TLR- 2和TLR- 4與tPROM孕婦或pPROM孕婦發(fā)生亞臨床絨毛膜羊膜炎均呈獨(dú)立相關(guān)性(P<0.05)。見表5。

2.7 檢測(cè)血清TLR- 2、TLR- 4對(duì)亞臨床絨毛膜羊膜炎的預(yù)測(cè)價(jià)值

經(jīng)ROC曲線分析，血清TLR- 2、TLR- 4對(duì)于tPROM組和pPROM組孕婦亞臨床絨毛膜羊膜炎都有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，曲線下面積(AUC)分別為0.657(95%CI0.579～0.743)、0.668(95%CI0.584～0.759)(圖2A)和0.793(95%CI0.711～0.918)、0.813(95%CI0.725～0.942)(圖2B)。

表4 PROM合并亞臨床絨毛膜羊膜炎孕婦與未合并亞臨床絨毛膜羊膜炎孕婦血清TLR- 1、TLR- 2、TLR- 4、TLR- 6水平比較ng·L-1Tab 4 The levels of serum TLR- 1,TLR- 2,TLR- 4 and TLR- 6 of PROM pregnant women with or without subclinical chorioamnionitisng·L-1

表5 tPROM和pPROM孕婦發(fā)生亞臨床絨毛膜羊膜炎的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

PROM是指足月分娩前胎膜的意外破裂，多數(shù)發(fā)生在妊娠37周之前。相較于tPROM，pPROM對(duì)母嬰結(jié)局的危害更大。胎膜一旦破裂，屏障保護(hù)立即消失，孕婦合并羊膜感染、絨毛膜羊膜炎、胎兒窘迫、胎盤早剝的風(fēng)險(xiǎn)則大大增加。據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道，30%～40%的早產(chǎn)與pPROM有關(guān)，而75%的圍產(chǎn)兒死亡與早產(chǎn)有關(guān)。在產(chǎn)科，對(duì)于PROM孕婦的治療是相當(dāng)棘手的，而且更多地采用單一的保守治療方案，包括抑制子宮收縮、使用抗生素預(yù)防感染、注射糖皮質(zhì)激素促進(jìn)胎兒肺成熟等。然而，傳統(tǒng)的治療效果并不令人滿意，絕大多數(shù)孕婦會(huì)在胎膜破裂1周內(nèi)分娩。因此，對(duì)于胎膜早破的早期診斷和預(yù)防十分重要。

本研究無論是pPROM還是tPROM孕婦，相較于對(duì)照組孕婦，血清TLR- 2、TLR- 4水平以及胎膜組織中TLR- 2 mRNA、TLR- 4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，而TLR- 1、TLR- 6變化則不明顯，且PROM孕婦血清TLR- 1、TLR- 2、TLR- 4、TLR- 6水平與胎膜組織中TLR- 1 mRNA、TLR- 2 mRNA、TLR- 4 mRNA、TLR- 6 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)，說明胎膜組織中TLR mRNA表達(dá)量的變化影響了孕婦血清中TLR水平，而PROM孕婦血清TLR- 2、TLR- 4水平的升高在一定程度上反映了胎膜破裂對(duì)機(jī)體先天性免疫防御機(jī)制的破壞。

TLR是機(jī)體防御感染的一種先天性免疫的基本機(jī)制[9]。相較于獲得性免疫機(jī)制，該系統(tǒng)發(fā)育更早，而且具有快速、非特異性和無需預(yù)先暴露于抗原反應(yīng)等特點(diǎn)。TLR屬于模式識(shí)別受體，通過識(shí)別病原微生物的群體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增強(qiáng)宿主的免疫反應(yīng)[10]。此外，TLR的存在使機(jī)體細(xì)胞能夠針對(duì)病原微生物迅速做出免疫反應(yīng)，將自身抗原與外源性抗原區(qū)分開來。與以前認(rèn)為胎膜組織是無菌的這一觀點(diǎn)不同，近年來大量研究表明胎盤含有一種獨(dú)特的、低水平的微生物群，可能影響出生結(jié)局；而且妊娠期陰道微生物組群的分類特征與胎盤微生物群也存在較大差異，胎盤微生物群更傾向于血行播散，而不是宮內(nèi)上升，因?yàn)檫@是傳染源進(jìn)入更常見的途徑[11]。因此，胎盤中所含的免疫防御系統(tǒng)很可能是防止共棲體和病原體傳播的關(guān)鍵。本研究PROM孕婦胎膜組織中TLR- 2 mRNA和TLR- 4 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組孕婦，說明胎盤破裂可能與胎盤中微生物群穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)。胎兒在宮內(nèi)發(fā)育階段，絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層作為先天免疫系統(tǒng)的一個(gè)分支，為胎兒提供了一道堅(jiān)固的防線[12]。此時(shí),胎膜組織中TLR mRNA的表達(dá)水平反映了胎兒是否受到病原體侵襲的壓力，而胎膜破裂后母體和胎兒循環(huán)之間的屏障消失，胎盤中的微生物群穩(wěn)態(tài)失衡，則胎膜組織自動(dòng)啟動(dòng)先天性免疫防御機(jī)制，從而使得TLR- 2 mRNA和TLR- 4 mRNA表達(dá)量上調(diào)。這也解釋了為何pPROM孕婦和tPROM孕婦血清中TLR- 2、TLR- 4水平都普遍升高的原因,但TLR- 1、TLR- 6水平變化不顯著，也可能與不同的TLR成員在系統(tǒng)中所起的作用不同有關(guān)。TLR- 4主要識(shí)別革蘭陰性細(xì)菌脂多糖。TLR- 2則是識(shí)別細(xì)菌脂蛋白、革蘭陽(yáng)性細(xì)菌肽聚糖、脂磷壁酸和真菌發(fā)酵多糖，并與TLR- 1、TLR- 6或TLR- 10形成異二聚體[13]。在識(shí)別病原體相關(guān)配體后，TLR二聚體啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子和抗菌肽的分泌，誘導(dǎo)干擾素刺激的基因(主要來自TLR- 2和TLR- 4)以及適應(yīng)性免疫反應(yīng)的激活。

除此以外，合并亞臨床絨毛膜羊膜炎的PROM孕婦血清TLR- 2、TLR- 4水平進(jìn)一步升高，且與亞臨床絨毛膜羊膜炎的發(fā)生相關(guān)，檢測(cè)母體血清TLR- 2、TLR- 4水平對(duì)亞臨床絨毛膜羊膜炎有一定的預(yù)測(cè)效能，尤其是血清TLR- 4水平對(duì)于pPROM孕婦發(fā)生亞臨床絨毛膜羊膜炎的預(yù)測(cè)效能較高(AUC>0.8)。亞臨床絨毛膜羊膜炎沒有表現(xiàn)出任何典型的感染癥狀，因此臨床上較難診斷。血清生化標(biāo)志分子因具有樣本易獲取、檢測(cè)方便、診斷靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，對(duì)早期診斷亞臨床絨毛膜羊膜炎有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。感染與PROM之間有一種公認(rèn)的臨床聯(lián)系，宮內(nèi)細(xì)菌感染通過進(jìn)入妊娠組織(如蛻膜、胎盤和胎膜)對(duì)妊娠構(gòu)成重大威脅。胎膜很可能是上升感染的第一個(gè)定植組織，盡管大多數(shù)正常足月分娩胎膜中有細(xì)菌的跡象，但炎癥與不良妊娠結(jié)局相關(guān)[14]。感染導(dǎo)致炎癥的方式被認(rèn)為是由先天性免疫模式識(shí)別受體(PRRs)介導(dǎo)的，例如TLRs。本研究中合并亞臨床絨毛膜羊膜炎的PROM孕婦血清TLR- 2、TLR- 4水平較對(duì)照組孕婦升高，說明亞臨床絨毛膜羊膜炎可能主要由含有TLR- 2的異二聚體或TLR- 4識(shí)別的病原體或微生物成分引起。Abrahams等[15]證實(shí)，雖然很多病原微生物都具有激活TLR- 2、TLR- 4的能力，但是對(duì)胎膜組織中TLR的表達(dá)影響有限，牙齦假單胞菌、革蘭陽(yáng)性金黃色葡萄球菌或大腸桿菌則可顯著激活胎膜組織中TLR- 2和(或)TLR- 4的表達(dá)，并且與早產(chǎn)及絨毛膜羊膜炎有關(guān)。此外，病毒感染后可通過上調(diào)TLR- 4和TLR- 2共同受體TLR627的表達(dá)，激活滋養(yǎng)層細(xì)胞中TLR- 2和TLR- 4的表達(dá)。

綜上所述，孕婦血清TLR- 2、TLR- 4水平升高與PROM以及合并亞臨床絨毛膜羊膜炎有關(guān)，這主要反映了PROM孕婦胎膜組織中TLR- 2和TLR- 4的激活狀態(tài)；并且檢測(cè)血清TLR- 2、TLR- 4水平對(duì)于PROM孕婦合并亞臨床絨毛膜羊膜炎有一定的早期預(yù)測(cè)價(jià)值。但是本研究仍存在一定的局限性，例如TLR在PROM和宮內(nèi)感染中的免疫調(diào)控機(jī)制尚不完全明確；并沒有根據(jù)致病菌類型的不同，對(duì)亞臨床絨毛膜羊膜炎患者血清TLR- 2、TLR- 4水平的差異進(jìn)行進(jìn)一步分組分析。