青頭菌(Russula virescens)聚酮合酶基因的克隆及碳源對該基因表達的影響

原曉龍, 王 毅, 楊文忠

(云南省林業和草原科學院，云南省森林培育與開發利用重點實驗室/國家林業和草原局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室，云南 昆明 650201)

食用菌因其上佳的口感、柔軟的質地和豐富的營養而廣泛地被人們所喜愛.青頭菌[Russulavirescens(Schff. ex Zart.) Fr.]是其中一種重要的野生食用菌.青頭菌又名綠菇，是一種紅菇科(Russulaceae)紅菇屬(Russula)擔子菌類真菌[1]，通常著生在闊葉或針葉樹種(如云南松等)根部形成外生菌根[2]，其子實體較大，味道濃郁鮮美、營養豐富[3]，長期以來被用作傳統中藥的民間藥方[4].目前關于青頭菌的分子生物學研究大多集中在系統進化、ITS鑒定[5]和DNA條形碼等[6]方面.青頭菌在成長過程中會產生戊基呋喃、辛酮和丁烯酮等聚酮類揮發性產物[3]，目前尚未發現有關青頭菌聚酮類化合物相關基因研究的報道.

大環內酯類、蒽環類、四環素類和聚醚類天然聚酮化合物具抗感染、抗真菌、抗腫瘤和免疫抑制等活性，這些聚酮類化合物在臨床上被廣泛應用[7]；聚酮類是由聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)催化合成的，聚酮合酶通過催化前體物質進行反復的縮合反應，可以形成多種聚酮體，再經過甲基化、氧化還原、糖基化等修飾反應形成各種各樣結構復雜的聚酮類化合物[8].本研究通過對青頭菌轉錄組數據的BLAST比對分析，獲得了一條PKS基因，通過RT-PCR克隆獲得該基因全長，并檢測了其在含不同碳氮源添加物培養基上的具體表達情況，以期為青頭菌品質研究、及具生物活性聚酮類生物合成提供基礎材料.

1 材料與方法

1.1 青頭菌菌株分離

將采集于云南省宜良縣的青頭菌帶回實驗室后，采用組織分離法，在無菌環境下將新鮮子實體的菌柄、菌蓋等不同部位的組織分離出來，切成小塊，置于PDA斜面培養基上，25 ℃恒溫環境培養.長滿管后，轉接2次平板，純化菌絲.純化后的菌絲經形態鑒定，及ITS(GenBank登錄號MW307354)、β-tubulin(GenBank登錄號MW307355)和elongation factor 1α(GenBank登錄號：MW307356)鑒定后，該菌種為青頭菌(R.virescens)，并將該菌株命名為Rv-yaf-001.

1.2 試劑與儀器

真菌RNA提取試劑盒(康為世紀公司)，高保真DNA聚合酶(TaKaRa公司)，NanoDropTM2000紫外分光光度計(賽默飛世爾科技公司)，真菌總RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)，反轉錄試劑盒(賽默飛世爾科技公司)，DNA純化試劑盒(Qiagen公司)，無縫克隆試劑盒(Biomiga公司).

1.3 RvPKS基因的挖掘和分離

首先以曲霉中已報道過的PKS基因為模板，利用本地BLAST對青頭菌基因組進行掃描，獲得可能含有PKS基因的contigs，然后利用antiSMASH(https://antismash.secondarymetabolites.org/)軟件進行驗證，并利用GENEFISH對contigs進行開放閱讀框掃描，通過生物信息學分析獲得青頭菌基因組中RvPKS基因的DNA序列以及蛋白序列.

根據DNA序列設計含起始密碼子的特異引物RvPKSF:5′-ATGGAACATCTGAATATCCC-3′，及含終止密碼子的特異引物RvPKSR:5′-ACGGCCTCTGCAATAATTGA-3′，以青頭菌cDNA為模板，用HiFi高保真DNA聚合酶用于RvPKS基因全長cDNA的克隆；經DNA純化試劑盒將該片段純化后，并將其連接到克隆載體Peasy-T3上，轉化到Trans-T1感受態細胞中.37 ℃培養24 h，進行菌落PCR后選擇含有插入片段的陽性克隆送到上海生工進行測序.

1.4 生物信息學分析

應用ExPASy數據庫(https://www.expasy.org/)中的ProtParam、SignalP、TargetP、Prosite和TMHMM對RvPKS蛋白對其理化性質、信號肽、細胞定位、保守結構域和跨膜結構域進行分析.并從美國生物技術信息中心(NCBI)上選擇功能已知且鑒定過化合物的蛋白序列用于聚類分析，采用MEGA 7.0中的Clustal W程序對所選擇的PKS蛋白序列和青頭菌中的RvPKS蛋白序列進行比對后，采用鄰位相接法(Neighbor-joining)，自檢舉1 000次，其余采用默認參數構建分子系統進化樹.依據聚類結果，從基因起源與功能分化的角度預測該基因功能，并進一步推測該基因產生的聚酮化合物.

1.5 RvPKS基因在不同培養基上的表達

根據RvPKS基因的DNA序列設計特異檢測引物(TRvPKSF:5′-AGAATCGCTTCAGAGTTG-3′, TRvPKSR:5′-ATGAACACCGAGTATCAC-3′).然后將青頭菌菌種培養在不同含量的碳源添加物培養基上，37 ℃恒溫培養箱中培養14 d后，從每種培養基上收獲0.5 g菌絲體，重復3次取樣，提取總RNA并選擇完整性較好和濃度合適的轉錄成cDNA.以MYA為基本培養基，分別添加2%和10%的葡萄糖、山梨醇、蔗糖、肌醇、麥芽糖、甘露醇和可溶性淀粉.然后以actin為陽性對照，采用RT-PCR以特異引物TRvPKSF和TRvPKSR檢測該基因的具體表達情況.

2 結果與分析

2.1 RvPKS基因的全長cDNA克隆

RvPKS基因的克隆測序結果(圖1)顯示，該基因(GenBank登錄號MT655136)的全長cDNA含有6 039 bp，可編碼氨基酸2 012個；保守結構域分析顯示該基因的蛋白結構域組織為：ACP酰基轉移酶(SAT)-β酮基合成酶(KS)-酰基轉移酶(AT)-酰基載體蛋白(ACP)-硫酯酶釋放結構域(TE).將該基因的cDNA全長于NCBI上進行BLASTN比對，未發現與該基因同源的基因；將其蛋白序列進行BLASTP比對發現，該蛋白與易碎軟齒菌(Dentipellisfragilis)的PKS(TFY72602.1)蛋白序列擁有最高的相似性，但其相似度僅為49.03%，說明該基因為尚未報道的PKS基因.

M：maker.圖1 RvPKS基因全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the full-length cDNA of the RvPKS gene

2.2 RvPKS蛋白的生物信息學分析

RvPKS蛋白分子質量為219.03 ku，理論等電點(pI)5.89，分子式為C9748H15372N2656O2910S8，其由2 012個氨基酸殘基組成，其中亮氨酸(Leu)、絲氨酸(Ser)和丙氨酸(Ala)為該蛋白中含量最高的3個氨基酸，酸性氨基酸數量191個，堿性氨基酸155個；該蛋白的不穩定系數(Ⅱ)是41.02，屬于不穩定蛋白；其脂肪族氨基酸系數為97.09，親水性平均系數(GRAVY)為0.061.經保守結構域分析表明，該蛋白含有SAT-KS-AT-ACP-TE等結構域，其中各結構域的保守活性氨基酸序列(圖2)為SAT(GIIGFSSGII)，KS(DTACSSSL)、AT(NVVEAHGTGTQ)、ACP(VVGHSLGEYVA)和TE(LGGWSLGGIIA)(粗體字代表高度保守氨基酸).SignalP-5.0預測顯示RvPKS蛋白無信號肽存在，TargetP 2.0預測結果顯示該蛋白定位于細胞質基質；SOPMA預測顯示該蛋白組成α螺旋的氨基酸有813個、β折疊289個、β轉角87個、無規則卷曲823個，分別占蛋白質氨基酸總數的40.41%、14.36%、4.32%和40.90%(圖3).青頭菌RvPKS蛋白與其他真菌PKS蛋白的聚類分析結果顯示(圖4)，該聚類樹分為5個分支，其中火絲菌(Pyronemaomphalodes, GenBank登錄號：CCX04910)、雞樅菌屬(Termitomycessp., GenBank登錄號：KNZ72615)、白環菇屬(Leucoagaricussp., GenBank登錄號：KXN83388)、烏氏曲霉(Aspergillusudagawae, GenBank登錄號：GAO84443)、絲曲霉(Aspergilluslentulus, GenBank登錄號：GFG17843)、Penicilliumsubrubescens(GenBank登錄號：OKP10856)和青頭菌PKS蛋白聚為一支，其結構域組織順序為SAT-KS-AT-ACP-TE，含有非還原型PKS的結構域SAT，即該蛋白編碼非還原型PKS；該分支中烏氏曲霉的PKS(GenBank登錄號：GAO84443)[9]、火絲菌的PKS(GenBank登錄號：CCX04910)[10]其蛋白產物為聚酮合酶，生物合成的產物為分生孢子色素，青頭菌RvPKS基因的終產物可能為分生孢子色素.

RvPKS：青頭菌PKS(Russula virescens)；DePKS：軟齒菌屬PKS(Dentipellis sp., GenBank登錄號：KAA1469652.1)；GtPKS：密褐褶孔菌PKS(Gloeophyllum trabeum, GenBank登錄號：XP_007866703.1)；HsPKS：小側溝香菇(Heliocybe sulcata, GenBank登錄號：TFK52663.1)；AgPKS：法國蜜環菌(Armillaria gallica, GenBank登錄號：PBK92884.1)，*表示豎列中的氨基酸完全一致，表示豎列中的氨基酸有3個以下的差異.圖2 青頭菌RvPKS蛋白各結構域的保守活性位點Fig.2 Conserved active amino acids sites of the RvPKS proteins in R.virescens

圖3 RvPKS蛋白的三級結構預測結果Fig.3 Prediction of the RvPKS protein tertiary structure

圖4 青頭菌RvPKS蛋白與其他真菌PKS蛋白的聚類分析Fig.4 Phylogenic analysis of the RvPKS in R.virescens and PKS proteins from other fungus

2.3 RvPKS基因的表達分析

RT-PCR結果顯示(圖5)：該基因在2%碳源含量條件下，添加山梨醇的培養基中，該基因表達量最高，后面從高到低依次為麥芽糖>葡萄糖>肌醇>蔗糖>甘露醇>可溶性淀粉；RvPKS基因在10%碳源含量條件下，表達量從高到低依次為蔗糖>葡萄糖>山梨醇>麥芽糖>甘露醇>肌醇>可溶性淀粉.說明該基因受不同含量糖類的誘導表達程度不同，但可溶性淀粉均不能強烈誘導該基因表達.

圖5 RvPKS基因在含不同碳源添加物培養基上的基因表達情況Fig.5 Relative expression of the RvPKS gene under mediums supplemented with various carbon sources

3 討論

目前，關于青頭菌的研究主要集中在青頭菌冷凍工藝[11]、化學成分[12,13]、子實體多糖的理化性質[14]、系統發育和ITS鑒定[15,16]、系統分類等方面，而關于青頭菌中聚酮類化合物及其基因的研究尚未見報道.本研究以青頭菌的基因組數據為基礎，分離獲得一條PKS基因，生物信息學分析顯示該基因的蛋白序列含有SAT-KS-AT-ACP-TE，其中SAT結構域為非還原型PKS特有的結構域[17]；與其它真菌進行比較，發現各結構域含有保守氨基酸序列，分別為SAT[G(I/V)(I/L)GFSSGI(I/L)]，KS(DTACSSS)、AT(HGTGT)、ACP(VVGHSLGEY)和TE(GGWSLGG)[18,19]；同時該蛋白含有KS-AT-ACP這3個聚酮合酶的最基本結構域[20]；分子系統進化樹顯示與青頭菌RvPKS蛋白聚為一支的其他真菌，其結構域組織順序均為SAT-KS-AT-ACP-TE；且其中烏氏曲霉的PKS(GenBank登錄號：GAO84443)[9]、火絲菌的PKS(GenBank登錄號CCX04910)[10]的終產物為分生孢子色素.這些證據均表明青頭菌RvPKS基因編碼非還原型PKS酶，其終產物可能為分生孢子色素.

青頭菌是一種與闊葉樹或針葉樹的根部共生的外生菌根菌，需要供給其合適的營養成分和生長條件才能使其孢子萌發、菌絲生長[21].離體培養時，不同的培養基會影響青頭菌菌種的菌絲生長速度[22]，青頭菌子實體中多糖含量成分較高，其單糖組分主要包括葡萄糖、甘露糖和果糖等[14]；同時滲透壓、不同碳氮源和不同含量的碳氮源添加物能影響真菌中聚酮類次生代謝產物和PKS基因的表達，如10%含量的山梨醇、2%和10%含量的蔗糖均能夠促使長松蘿中UlPKS基因的大量表達[23].因此，本研究在基礎培養基上，添加不同種類和濃度的碳源添加物以研究碳源添加物對RvPKS基因表達的影響.結果表明，不同含量的碳源添加物對該基因表達影響差異顯著，其中在2%碳源含量條件下，山梨醇對該基因的表達的影響最為強烈；在10%碳源含量條件下，蔗糖對該基因表達的影響最為強烈.這種同一基因在不同培養條件下表達量明顯差異的現象是因其受到滲透壓、培養基成分和酶抑制劑等的影響，使同一蛋白酶受到正或負反饋，進而進入不同的代謝通路，產生不同的次級代謝產物，是一種通過微生物基因組數據挖掘獲得骨架新穎、活性不同的次級代謝產物的有效途徑[24,25].本研究以基因組數據為基礎，結合生物信息學分析成功分離得到一條青頭菌的RvPKS基因，并對其功能進行預測分析，并檢測該基因在不同碳源條件下的具體表達，為鑒定和異源表達青頭菌中聚酮合酶基因提供依據.